ИСТИНА

В последнее время очень острой проблемой современной медицины является возрастающая антибиотикорезистентность патогенов. В 2018 году ВОЗ причислил Klebsiella pneumoniae к наиболее опасным бактериям в связи с их резистентностью к существующим антибактериальным препаратам. Одним из способов борьбы с клебсиеллой – подавление ее роста. Недавно было показано, что некоторые штаммы молочнокислых бактерий могут эффективно ингибировать K. pneumoniae при ее росте в виде биопленок. Одним из таких штаммов является Limosilactobacillus reuteri, секретирующие в среду несколько типов ферментов, которые можно разделить на внеклеточные и внутриклеточные. Эти ферменты можно классифицировать на 3 типа: протеазы, воздействующие на клеточные стенки клебсиеллы, гидролазы нуклеиновых кислот и ферменты метаболизма лактобактерий. Довольно большой интерес вызывают продукты метаболизма (L-, D-лактатдегидрогеназы и цистеинсинтаза), т.к. они секретируются в большом количестве на контакте с биопленками патогенами. [1] В качестве объекта исследования нами был выбрана – L-лактатдегидрогеназа. Это фермент, катализирующий реакцию превращения пирувата в лактат с сопряженным окислением NADH в NAD+. Нами были проанализированы базы данных и найдена последовательность, соответствующая L-LDH из L.reuteri (LreLLDH). Далее были спроектированы праймеры на основе данной последовательности, конструкция которых предполагает два варианта расположения дополнительного His-tag участка на С- или N- концах, необходимого для очистки белка. После этого были получены два варианта плазмидной ДНК с генами LreLLDH_NHis и LreLLDH_СHis, которыми была произведена трансформация клеток E.coli для дальнейшей наработки LreLLDH . Для полученных двух форм были проведены подбор и оптимизация условий экспресии. Оптимизация проводилась по двум параметрам: концентрация индуктора IPTG и поглощения культуральной среды в момент индукции. Наличие целевого фермента подтверждали с помощью белкового электрофореза и масс-спектрометрии MALDI/TOF/TOF. Очистку обеих форм белка проводили с помощью аффинной металхелатной хроматографией. Для нее также был проведен подбор условий и подобрана точная концентрация имидазола, при которой белок перестает связываться с колонкой, что значительно увеличивает выход очистки. *Белок выделен из лактобактерий Limosilactobacillus reuteri. Штамм бактерий был предоставлен Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ, грант 23-64-10029