ИСТИНА

Одним из ключевых факторов инициации трансляции у эукариот является ГТФаза eIF2. При классическом механизме инициации трансляции eIF2 в комплексе с ГТФ доставляет Мет-тРНКi в Р-сайт 40S рибосомной субчастицы и участвует в последующем сканировании 5’-нетранслируемой области. В условиях клеточного стресса eIF2 фосфорилируется, что приводит к драматическому падению общего уровня трансляции. Тем не менее, некоторые мРНК продолжают транслироваться, следовательно, существуют альтернативные механизмы доставки тРНК в Р-сайт. Фактор инициации eIF2D, открытый недавно в нашей лаборатории, тоже способен располагать тРНК в Р-сайте 40S субчастицы – однако, в отличие от eIF2, он может работать не только с Мет-тРНКi, но и с элонгаторными и даже с деацилированными тРНК. В системе in vitro человеческий eIF2D способен заменить eIF2 в образовании 48S инициаторного комплекса с мРНК, инициация трансляции которых не требует сканирования 5’-НТО (безлидерной мРНК, мРНК с IRES-элементом вируса HCV и др.) Однако функция eIF2D в живой клетке, а также клеточные мРНК и условия, при которых eIF2D может участвовать в трансляции, до их пор неизвестны. Ортолог человеческого фактора eIF2D в дрожжах S. cerevisiae – TMA64. Известно, что ген TMA64 индуцируется между фазами МI и МII при мейозе (в процессе споруляции). Нокаут ∆tma64 жизнеспособен, но чёткие данные о его фенотипических проявлениях отсутствуют. Данные об эффективности споруляции штамма ∆tma64 также противоречивы. В работе исследовался фенотип S. cerevisiae c различным уровнем экспрессии гена TMA64. Для исследования были получены штаммы SK1 S. cerevisiae с нокаутом гена TMA64 и с его оверэкспрессией на основе плазмиды pYES2. В ходе работы было показано влияние нокаута TMA64 на скорость роста дрожжей, причём влияние оказалось позитивным: в среде YPD при 30⁰С скорость роста диплоидов, содержащих нокаут (время удвоения 1,8 часа), превышает скорость роста диплоидов дикого типа (время удвоения 2 часа). В то же время для гаплоидных штаммов скорость роста оказалась одинаковой. Такая зависимость проявления фенотипа от плоидности может говорить об участии данного белка в процессах, связанных с гомологичной рекомбинацией при репарации ДНК. Кроме того, оказалось, что эффект нокаута TMA64 на рост диплоидов зависит от условий культивирования дрожжей: при замене в среде источника углерода с глюкозы на ацетат калия диплоидные штаммы wt и ∆tma64 показали одинаковую скорость. Было также обнаружено изменение морфологии колоний в ответ на отсутствие гена TMA64: колонии SK1 дикого типа имели уплощённую форму с широким краем (меньшее число клеток было расположено в центре колонии, большее – на периферии, что для SK1 является нормой при ограничении питательных веществ), в то время как штамм ∆tma64 образовывал округлые выпуклые колонии. Можно предположить, что TMA64 участвует в отрицательном контроле клеточного цикла при неблагоприятных условиях среды – в частности, в ответе на глюкозное голодание или на повреждение ДНК. Оверэкспрессия гена TMA64 привела к драматическому снижению скорости роста дрожжей и к изменению морфологии клеток (увеличению линейных размеров клеток в 1,5- 2 раза). Колонии клеток с оверэкспрессией TMA64 имели морфологию дикого типа. При изучении влияния нокаута гена TMA64 на эффективность споруляции дрожжей было обнаружено, что диплоиды ∆tma64 спорулируют с меньшей эффективностью, чем wt: процентное содержание тетрад в спорулирующей культуре последних составило 83%, в то время как ∆tma64 образовывали лишь 37% тетрад. Такая разница может быть связана как с неадекватным ответом мутантных дрожжей на недостаток аминокислот (поскольку процесс споруляции у дрожжей запускается при азотном голодании), так и с нарушениями в ходе мейотических делений (в частности, при кроссинговере) – что вписывается в вышеупомянутое предположение об участии ТМА64 в ответе на стресс или в рекомбинации. Проверка этих гипотез требует дополнительных экспериментов.