ИСТИНА

Короткие открытые рамки считывания (кОРС, <300 нуклеотидов) обнаружены в геномах прокариот и эукариот, однако часто пропускаются автоматическими алгоритмами при аннотации. Тем не менее, показано, что кОРС могут кодировать функциональные пептиды/микробелки, важные для регуляции различных физиологических процессов [1]. Однако функции большинства пептидов, кодируемых кОРС, изучены мало, особенно у растений. Ранее в лаборатории была обнаружена кОРС, расположенная на транскрипте, аннотированном как длинная некодирующая РНК у модельного растения Physcomitrella patens [2]. Её транскрипция и трансляция были подтверждены. Пептид размером 41 а.о. был назван PSEP1. Мы показали, что эндогенный пептид PSEP1 участвует в регуляции скорости роста растений мха: при сверхэкспрессии этого пептида у растений наблюдается значительное ускорение, а при его нокауте - замедление роста [2]. Известно, что пептиды/микробелки, кодируемые кОРС, могут взаимодействовать с белками, влияя на их активность и стабильность [1]. Следовательно, для описания функции микробелка необходимо определить его белковых партнёров. С этой целью нами была проведена аффинная хроматография с применением рекомбинантного PSEP1 со стрептавидиновым тэгом. Для стабилизации возможных слабых белок-белковых взаимодействий при нефизиологических условиях хроматографирования мы применили бифункциональный кросс-сшивающий агент DSP. Для подтверждения результатов аффинной хроматографии мы использовали более приближенный к физиологическим условиям метод выявления белковых партнёров - коиммунопреципитацию. Мы получили мутантные линии Ph. patens, экспрессирующие PSEP1, слитый с FLAG-пептидом (8 а.о.). Для изоляции белковых партнёров применили сорбент с иммобилизованными антителами против FLAGпептида. В обоих методах белки-партнёры анализировали масс-спектрометрически. Список выявленных кандидатов белковых партнёров пептида PSEP1 включает кальмодулин, белок Rab6A, ассоциированный с патогенезом белок PR-10 и несимбиотический гемоглобин класса 1. Стабильно определяющимся кандидатом по результатам двух вышеописанных экспериментальных методик является белок Rab6A, малая ГТФ-аза, регулирующая везикулярный транспорт. Для изучения влияния PSEP1 на везикулярный транспорт мы сравнили сверхэкспрессирующую и нокаутную по этому пептиду линии с диким типом при окрашивании красителем FM1-43, флуоресцирующим в мембранах. Было показано, что интенсивность везикулярного транспорта у нокаутной линии значимо ниже, а у сверхэкспрессирующей линии - значимо выше, чем у дикого типа. Результаты позволяют предположить, что микробелок PSEP1 регулирует процессы роста растений, воздействуя на интенсивность везикулярного транспорта.