ИСТИНА

Ферменты в силу их высокой каталитической активности и субстратной специфичности все шире используются на практике. Однако природные ферменты не удовлетворяют требованиям практики в силу высокой стоимости получения, низкой стабильности и адаптации к природным соединениям. В нашей лаборатории проводятся систематические исследования взаимосвязи структура-функция физиологически и практически важных ферментов. За последние 3 года нами были получены новые и улучшенные формы различных биокатализаторов. 1. Формиатдегидрогеназа (ФДГ. Клонированы новые гены ФДГ из бактерий Moraxella sp.C1 (MorFDH), Stathylococcus aureus (StaFDH), дрожжей Ogataea parapolymorpha (OpaFDH), Saccharomyces cerevisiae (SacFDH), осуществлена суперэкспресси генов этих ФДГ в клетках E.coli. Рекомбинантные ферменты были выделены и охарактеризованы, для некоторых получены кристаллы и решены структуры. Показано, что StaFDH обладает самой высокой активностью из описанных ФДГ (минимум в 2,5 раза), а OpaFDH имеет низкие значения КМ по субстратам. Оба фермента по стабильности уступают только ферменту из бактерий Pseudomonas sp.101 (PseFDH). Получены мутантные формы этих ферментов, а также ФДГ из других источников с улучшенными каталитическим свойствами и стабильностью. Получена химерная форма MorFDH и PseFDH. Разработана методика определения стабильности ФДГ в мочевине, позволяющая сравнивать стабильность в обратимых условиях. Предложен метод бесхроматографической очистки ФДГ в двухфазных системах вода-полиэтиленгликоль-соль. Проведено сравнительное изучение активности и стабильности природных ФДГ и их мутантов в ионных жидкостях - альтернативной среде для проведения биокаталитических процессов. 2. Оксидаза D-аминокислот (DAAO). Продолжены эксперименты по белковой инженерии DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis. Получены мутанты с повышенной стабильностью и активностью с цефалоспорином С, а также мутанты с узкой субстратной специфичностью для медицинской диагностики D-аминокислот, участвущих в регуляции нервной деятельности. Клонированы новые гены DAAO из дрожжей Hansenula polymorpha (Ogataea parapolymorpha). Получены нокаутные по данному ферменту штаммы H.polymorpha. 3. Ферменты синтеза пенициллиновых антибиотиков. Клонирован ген одной из самых термостабильных пенициллнацилаз (РА) из Alcaligenes faecalis DSMZ 30030. Получена одноцепочечная форма такого фермента, которая не отличается по каталитическим свойствам от природного гетеродимера. Клонирован ген альтернативного фермента синтеза альфа-аминопенициллинов и цефалоспоринов - гидролазы эфиров альфа-аминокислот. Показано, что при оптимальных условиях данный фермент исключительно эффективен в синтезе ряда пенциллинов и цефалоспоринов. Работа поддержана Российским научным фондом (грант 16-14-00043) и Российским фондом фундаментальных исследований (гранты 15-54-78035-Итал_а, 16-34-01320-мол_а, 17-04-01469а, 17-04-01487а, 17-04-01662а).