ИСТИНА

Современное представление о вирусном и бактериальном патогенезе предполагает возможность конкурентных взаимоотношений между транспортом макромолекул хозяина и патогена. Например, бактерии синтезируют и «впрыскивают» в растительную клетку пептидазы, обеспечивающие трофику патогена. В ответ на это растительная клетка индуцирует транскрипционную активность генов, обеспечивающих синтез разнообразных ингибиторов пептидаз, включая Kunitz peptidase inhibitor (KPI). Ранее мы идентифицировали и выделили из генома Nicotiana benthamiana ген, имеющий гомологию с генами, кодирующими KPI (NbKPI). Однако в отличие от известных KPI исследуемый нами NbKPI потерял способность ингибировать сериновые пептидазы. Мы предположили, что NbKPI приобрел способность влиять на межклеточный транспорт макромолекул, обеспечивая защиту растения. Для доказательства этого предположения мы использовали несколько экспериментальных приемов. Первый подход состоял в исследовании состояния межклеточного транспорта в листьях растений при использовании реперных молекул. В норме плазмодесмы листа не способны пропускать молекулы размером более 40 кДа. В своих экспериментах мы использовали молекулу 2xGFP (мол. масса 54 кДа). Транспорт 2xGFP из одной клетки в другую свидетельствует об «открытом» состоянии плазмодесм, характерном для листа, подвергающегося атаке патогена. Мы проводили совместную агроинфильтрацию листьев 35S-2xGFP с пустым бинарным вектором или с конструкцией, обеспечивающей повышенную экспрессию NbKPI. Затем через 24-30 часов после агроинъекции подсчитывали кластеры светящихся клеток с помощью флуоресцентного светового микроскопа. Мы показали, что при повышенном синтезе NbKPI, отмечается усиление межклеточного транспорта, когда более чем 50% флуоресцентных сигналов было распределено между 2-3-4- клеточными кластерами. Другой прием состоял в использовании известного генетикам метода комплементации. Известно, что транспортный белок (ТБ) вируса табачной мозаики (ВТМ) способен эффективно увеличивать пропускную способность плазмодесм и участвует в транспорте как вирусной РНК, так и GFP, синтезируемого с вирусного вектора на основе ВТМ (ВТМ-GFP). При введении в ВТМ-GFP мутаций, приводящих к нарушению синтеза ТБ, GFP детектируется в одиночных клетках. Если функция NbKPI состоит в открытии плазмодесмальных «ворот», то совместное введение в клетку ВТМ-GFP, кодирующего дефектный ТБ, и NbKPI приведет к комплементации функции транспорта дефектного ТБ, в результате чего появятся многоклеточные кластеры, содержащие GFP. И действительно, мы выявили способность NbKPI комплементировать функцию транспорта дефектного ТБ ВТМ. Мы заключили, что идентифицированный нами KPI N.benthamiana обладает способностью взаимодействовать с плазмодесмой и стимулировать межклеточный транспорт макромолекул в растении. Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ МД-5697.2016.4 и гранта РФФИ 16-34-00062_мол_а.