ИСТИНА

Введение. Инсульт, как одна из основных причин смертности населения, является следствием нарушения мозгового кровотока, что сопряжено с тромбообразованием и сопровождается появлением активных факторов свертывания, а также ведет к развитию нейровоспаления, в ходе которого происходит нарушение целостности ГЭБ и проникновение активных факторов гемостаза в ткань мозга. Тромбин, ключевая сериновая протеаза гемостаза, способен активировать специфические протеаза-активируемые рецепторы (ПАР) [1, 2], которые широко экспрессируются в мозге [3]. Существует 4 типа ПАР. На данный момент показано, что тромбин способен активировать ПАР-1, -3 и -4 [5]. Экспрессия ПАР в астроцитах, которые являются важным клеточным участником и регулятором нейровоспаления [2]. При этом ведущую роль в провоспалительной активации астроцитов играет ПАР1 [4]. Таким образом, данная работа посвящена изучению ПАР1-опосредованного действия тромбина на культивируемые астроциты. Материалы и методы. Эксперименты выполнены на первичных культурах астроцитов крысы. Культуру клеток получали из коры больших полушарий новорожденных крыс (0-3 дней) по протоколу, описанному ранее [5]. Пролиферацию клеток измеряли методами MTT и WST-1. В основе этих методов лежит восстановление солей тетразолия МТТ и WST-1 до формазана оксидоредуктазами митохондрий живых клеток, после чего осуществляется спектрофотометрическое (НАДО ДОБАВИТЬ ДЛИНУ ВОЛНЫ НА КОТОРОЙ ПРОВОДИЛИ ИЗМЕРЕНИЯ BioRad, Microplate Absorbance Reader, iMark™) измерение количества восстановленного продукта. Секрецию NO измеряли по накоплению нитрит-ионов в среде культивирования с помощью реактива Грисса. Уровень β-гексозаминидазы в среде культивирования астроцитов и внутриклеточный уровень фермента оценивали по фермент-субстратной реакции с использованием окрашенного субстрата (4-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозамин). Состояние актинового цитоскелета астроцитов определяли иммуноцитохимически с использованием флуоресцентно меченного токсина, специфически связывающего F-актин, Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen™), и Höechst 33342 (Invitrogen™) для окрашивания ядер. Детекцию флуоресценции проводили на сканирующем конфокальном микроскопе LSM 510 (Carl Zeiss, Германия) с использованием программного обеспечения ZEN. Топографию и жесткость (модуль Юнга) мембраны клеток исследовали с использованием сканирующей ион-проводящей микроскопии (SICM; сборка ICAPPIC Limited, Великобритания) на инвертированном микроскопе Eclipse Ti-2 (Nikon, Япония) Для определения вклада ПАР1 в активацию клеток использовали агонист ПАР1, TRAP6, и антагонист ПАР1, SCH79797. Статистическую обработку результатов проводили с использованием GraphPad Prism 8.0.1. Результаты и обсуждение. Аппликация тромбина в концентрациях 1-100 нМ через 48 часов приводила к повышению пролиферации астроцитов на 30-40% по сравнению с контролем (рис. 1, а). При этом, блокада ПАР1 антагонистом SCH79797 (1 мкМ) приводила к полной отмене этого эффекта тромбина. В результате уровень пролиферации не отличался от значений в контроле (рис. 1, б). Таким образом, показано, что тромбин стимулирует пролиферацию астроцитов преимущественно через ПАР1. Данный процесс, вероятно, опосредуется по внутриклеточному сигнальному пути с вовлечением Gαq белка [6].Применение тромбина в концентрации 100 нМ вызывало значимое повышение секреции NO на 19% через 48 часов, тогда как при воздействии тромбина (50 нМ) происходило снижение высвобождения NO (NO лишь на 7% выше, чем в контроле, рис. 2, а). Секрецию β-гексозаминидазы, фермента лизосом, анализировали через 4, 24 и 48 часов после воздействия тромбина. Значимое повышение секреции β-гексозаминидазы на 30,5% наблюдалось через 24 часа после воздействия тромбина в концентрации 100 нМ. Спустя 48 часов значимое повышение секреции фермента наблюдалось и при 50 нМ тромбина на 36,5%, и при 100 нМ тромбина на 50% (рис. 2, б). Следовательно, можно предположить более высокую специфичности тромбина по индукции секреции β-гексозаминидазы, в сравнении с NO.Ранее методом сканирующей ион-проводящей микроскопии на клетках линии PC-3 было показано, что при обработке клеток цитохалазином нарушается полимеризация актина, что приводит к изменению жесткости клеток, преимущественно на периферии клеток [7]. До настоящего времени не было данных об изменении жесткости мембраны (модуль Юнга) в условиях провоспалительной активации астроцитов. С помощью метода сканирующей ион-проводящей микроскопии в режиме измерения жесткости было показано, что применение тромбина (50 нМ) и агониста ПАР1, TRAP6 (100 мкМ) жесткости клеточной мембраны возрастала уже через 3 минуты после воздействия, которое сохранялось в течение всех 15-ти минут сканирования (рис. 3, в, г). В среднем, за все время сканирования жесткость при воздействии TRAP6 увеличилась на 49%, а при воздействии тромбина – на 39% (рис. 3, а). Сразу после сканирования на SICM клетки фиксировались с помощью PFA 4% при комнатной температуре в течение 20 минут, и проводилось окрашивание клеток на F-актин (Phalloidin-Alexa Fluor 488 нм) и ядерный хроматин (Höechst 33342, 405 нм) по методике, описанной ранее [3]. Состояние актинового цитоскелета, уровень формирования F-актина, определяли как среднюю интенсивность флуоресценции меченного фаллоидина в клетке. Так, воздействие тромбина (50 нМ) повышало сборку F-актина на 16% (рис. 4, в) а TRAP6 (100 мкМ) – на 82% по сравнению с контрольными условиями (рис. 4, а). Таким образом, можно предположить, что полимеризация актина может частично обеспечивать повышенную жесткость мембраны в астроцитах при их ПАР1-зависимой активации.