ИСТИНА

Формиатдегидрогеназа (ФДГ, КФ 1.2.1.2.) катализирует реакцию прямого переноса гидрид-иона с субстрата (формиат-иона) на никотинамидное кольцо кофермента NAD(P)+. Большинство ФДГ обладают высокой специфичностью к коферменту NAD+ и они широко используются для регенерации NADH в процессах тонкого органического синтеза, в первую очередь для получения хиральных соединений с помощью дегидрогеназ. В случае NADP+ известна только одна ФДГ, у которой каталитическая эффективность с этим коферментом выше, чем с NAD+ [1]. В настоящее время существует большое количество важных процессов получения хиральных соединений с использованием NADPH и их внедрение сдерживается отсутствием высокоактивных NADP+-специфичных формиатдегидрогеназ. Поэтому получение ФДГ с измененной коферментной специфичностью является важной и актуальной задачей. Следует отметить, что в ходе реакции кофермент связывается в отдельном домене и определяющую роль его высокой специфичности к NAD+ играет остаток Asp221. Замена данного отрицательно заряженного остатка Asp221 на незаряженный остаток может устранить отталкивание зарядов между карбоксильной группой Asp221 и 2'-фосфатной группой NADP+, что может увеличить коферментную специфичность данного фермента к NADP+. Справедливость такого предположения была подтверждена экспериментально на примере бактериальных ФДГ из Pseudomonas sp. 101 [2] и Burkholderia stabilis [1]. Ранее в нашей лаборатории была получена мутантная NADP+-специфичная ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 (PseFDH), которая получила обозначение PseFDH T5M8. В данной работе были продолжены эксперименты по инженерии коферментной специфичности PseFDH и получена новая мутантная PseFDH Sm4s2/D221Q. Были определены кинетические параметры мутантных PseFDH Sm4s2/D221Q и PseFDH T5M8 в реакциях с NAD+ и NADP+, а также изучена их термостабильность. Показано, что оба фермента обладают высокой специфичностью к NADP+. Новый мутант PseFDH Sm4s2/D221Q по каталитической эффективности с NADP+ превосходит все известные в настоящее время NADP+-зависимые ФДГ. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 11-04-00920-а и 12-04-31740-мол_а).