ИСТИНА

SARS-CoV-2, являющийся этиологическим агентом коронавирусного заболевания COVID-19, принадлежит к несистемной группе одноцепочечных (+) РНК вирусов. Основная проблема при изучении молекулярных основ репликации подобных патогенов заключается в невозможности работы с полноразмерным вирусом в лабораториях, не имеющих соответствующих разрешений. Целью данной работы является создание псевдовирусной системы для исследования базовых этапов жизненного цикла коронавирусов: репликации РНК-генома и прерывистой транскрипции. Репликация и транскрип-ция SARS-CoV-2 осуществляются РНК-зависимым РНК-полимеразным комплексом (RdRp), компоненты которого закодированы в ORF1a/b. RdRp комплекс необходим для наработки геномной полноразмерной РНК и продукции укороченных субгеномных РНК (sgРНК). sgРНК образуются в ходе прерывистой транскрипции: RdRp комплексы с синтезируемой РНК диссоциируют от РНК матрицы в сайтах регуляции транскрипции (IGR), перемещаются в 5’-концевую область генома, и завершают синтез sgРНК. К сожалению, до сих пор не существует удобной модели для поиска потенциальных вирусных и клеточных регуляторов процессов репликации и транскрипции генома SARS-CoV-2. В данной работе разработан репликон, состоящий из 5'-UTR SARS-CoV-2, генов устойчивости к пуромицину и люциферазы светлячка (Fluc), соединенных последовательностью, кодирующей T2A-пептид, IGR SARS-CoV-2, необходимого для протекания прерывистой транскрипции, гена люциферазы Renilla (Rluc), а также 3'-UTR SARS-CoV-2. В отсутствие репликативного аппарата SARS-CoV-2 с репликона синтезируется лишь ген устойчивости к пуромицину и Fluc, однако при коэкспресии репортера с белками из ORF1a/b протекают процессы вирусной репликации и прерывистой транскрипции, что приводит к увеличению уровня продукции Fluc, а также эффективному синтезу Rluc. Соотношение Rluc/Fluc может быть использовано для оценки эффективности процесса прерывистой транскрипции. С использованием этой системы нами определен минимальный набор вирусных белков из ORF1a/b, необходимых для протекания прерывистой транскрипции. Созданная система была также применена для скрининга потенциальных ингибиторов вирусной полимеразы. Работа поддержана грантом РФФИ 20-04-60216.