ИСТИНА

У млекопитающих метилирование ДНК по остаткам цитозина в CpG-сайтах осуществляет de novo ДНК-метилтрансфераза (МТазой) Dnmt3a. C-концевой каталитический домен белка (Dnmt3a-CD) проявляет метилирующую активность даже в отсутствии N-концевой регуляторной области. В промоторах некоторых генов доказано существование G-квадруплексов (G4). Промоторы онкогенов, в отличие от генов-супрессоров опухолей, должны быть метилированы, однако данные о возможном влиянии G4 на метилирование отсутствуют. Целью работы стало установление закономерностей влияния G4 на метилирование ДНК МТазой Dnmt3a-CD. В качестве модельных систем были взяты ранее разработанные синтетические ДНК-дуплексы с встроенными G4 и петлеобразными структурами. ДНК-дуплекс 76/95-G4 содержит в своем составе последовательность (GGGT)4, которая складывается в параллельный квадруплекс. В качестве контроля использован ДНК-дуплекс 76/95-loop с неструктурированным (GT)8-трактом. Дизайн системы позволяет проследить за метилированием конкретного CpG-сайта, находящегося на значительном расстоянии от неканонической структуры и входящего в сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции R.Hin6I. Эффективность метилирования ДНК-дуплексов МТазой Dnmt3a-CD изучена методом защиты от расщепления ДНК эндонуклеазой R.Hin6I. Отработаны условия определения степени метилирования конкретного CpG-сайта в составе ДНК-дуплексов и рассмотрено влияние концентрации Dnmt3a-CD на их метилирование. При высокой концентрации белка статистически значимой разницы в эффективности метилирования ДНК-дуплексов не выявлено. При пониженной концентрации Dnmt3a-CD, согласно предварительным данным, метилированию подвергается только канонический ДНК-дуплекс 76/76. Таким образом, наблюдается зависимость эффективности метилирования модельных ДНК-дуплексов от наличия G4 в их составе. В ходе дальнейшей работы планируется варьировать расстояние между метилируемым CpG-сайтом и G4 с целью выявить влияние наличия G4 на активность Dnmt3a-CD. Результаты настоящего исследования позволят определить роль квадруплексных структур в процессе метилирования ДНК.