ИСТИНА

Больничные инфекции в настоящее время являются серьёзной проблемой. Больницы – это место скопления людей, очень часто с ослабленным иммунитетом. Кроме этого, возбудители инфекций часто имеют повышенную устойчивость к антибиотикам. Одними из таких опасных патогенов являются бактерии рода Klebsiella. Эти бактерии вызывают пневмонию, сепсис, воспаление мочеиспускательной системы, а резистентность их к антибиотикам с каждым годом возрастает. Кроме этого, было обнаружено, что бактерии данного рода при применении антибактериальных агентов переходят в форму биоплёнки, и обычные дозы антибиотиков полностью уничтожить их не могут. Ранее было обнаружено, что при совместном культивировании Klebsiella с бактериями рода Lactobacillus последние вырабатывают низкомолекулярные соединения и белки (ферменты), которые ингибируют рост патогена. Лактобактерии содержатся в кишечнике здорового человека, а потому их применение не вызывает иммунный ответ. Протеомный анализ некоторых видов бактерий Lactobacillus показал, что одним из ферментов, участвующим в уничтожении патогенных бактерий, является фермент RihC (рибонуклеозидгидролаза С). Было обнаружено, что фермент RihC синтезируется в Lactobacillus reuteri в ответ на присутствие бактерий рода Klebsiella. С помощью методов генетической инженерии была получена плазмида, содержащая ген фермента RihC из L.reuteri (LreuRihC). Для удобства очистки на 3’-конце гена была введена дополнительная нуклеотидная последовательность, кодирующая 6 остатков гистидина (His-tag). Плазмида с геном фермента RihC была трансформирована в компетентные клетки E.coli штамма BL-21. Были проведены эксперименты по подбору оптимальных условий экспрессии данного фермента. Варьировались следующие параметры: состав питательной среды (использовались среды LB, 2YT, TB), температура экспрессии (диапазон 19-21°С). Эксперименты показали, что уровень экспрессии оставался примерно одним и тем же независимо от варьированных параметров, хотя выход биомассы в среде TB было больше, чем в средах LB и 2YT. Была проведена очистка фермента после разрушения клеточной массы ультразвуком с помощью аффинной хроматографии. У очищенного фермента было проверено наличие ферментативной активности. Сделано это было с помощью гидрофильной хроматографии (ГИХ) при сотрудничестве кафедры химической энзимологии с лабораторией хроматографии кафедры аналитической химии химического факультета МГУ. Также с помощью ГИХ проведены измерения скорости ферментативного превращения уридина в урацил. Таким образом, был получен рекомбинантый фермент LreuRihC, обладающий ферментативной активностью, начаты измерения кинетических параметров данного фермента.