ИСТИНА

NADP)+-зависимая формиатдегидрогеназа (КФ 1.2.1.2, ФДГ) найдена в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах и растениях. Этот фермент играет важную физиологическую роль в различных организмах, в том числе является белком стресса. ФДГ широко применяется в тонком органическом синтезе вместе с другими оксидредуктазами в виде смесей ферментов, а также “слитых» в одну полипептидную цепь. Роль ФДГ заключается в регенерации восстановленного кофермента. Кроме того, ФДГ применяется в биоаналитических целях для определения формиата и NAD+ в различных биологических жидкостях. Для успешного применения на практике необходимо, чтобы фермент обладал высокой каталитической эффективностью, был устойчивым к различным внешним воздействиям, а также процесс получения и очистки фермента был простым и быстрым. В нашей лаборатории формиатдегидрогеназа систематически изучается уже много лет. Нами накоплен большой опыт по получению генетических конструкций, содержащих гены ФДГ, разработке методик экспрессии и эффективной очистке, а также сайт-направленному мутагенезу. Ранее нами было проведено клонирование ФДГ из термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha DL1 (OpaFDH), которая обладает высокой специфической активностью, а также термостабильностью. Для этого фермента также была получена мутантная форма, обладающая более высокой химической стабильностью. Также нами были получены кристаллы этой ФДГ и решены пространственные структуры. Фермент был успешно использован для разработки метода определения микроконцентраций NAD+ в препаратах мозга [1]. В настоящее время ведется апробация метода в клинике Кардиологическоо центра. Для многих ФДГ также было показано, что аминокислотные остатки на N-конце оказывают значительное влияние на уровень экспрессии и свойства этих ферментов. С целью дальнейшего улучшения стабильности и операционных свойств фермента нами было проведено моделирование N-концевой последовательности OpaFDH, выбраны аминокислотные остатки для вставки на N-конец фермента. Было получено три новых фермента с модифицированной последовательностью N-конца, а также изучены их основные свойства. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Москвы в рамках научного проекта No 21-34-70046 мол_а_мос.