ИСТИНА

Фотоактивные флуоресцентные белки активно используются для микроскопии сверхвысокого разрешения, поэтому поиск новых фотоактивных белков и изучение их свойств чрезвычайно важны. Фотоактивность может проявляться в обратимом переключении между состояниями с различным квантовым выходом флуоресценции, изменении формы спектра или разгорании флуоресценции. Периодически появляются данные о новых фотоактивных флуоресцентных белках, однако часто без описания механизмов фототрансформации. В данной работе мы изучили «фотоконверсию» красного флуоресцентного белка mKate2. Сообщение о возможной фотоактивности красных флуоресцентных белков из этой группы появилось в 2009 году в работе Кремерса с соавторами на клетках, экспрессирующих белки mKate и Katushka. Авторы этой статьи утверждают, что при интенсивном облучении белок переходит из красной формы в зеленую. Чтобы проверить это предположение мы провели анализ спектральных характеристик mKate2 с помощью флуоресцентной микроскопии, абсорбционной спектроскопии и флуоресцентной спектроскопии с пикосекундным временным разрешением. Полученные нами данные показали, что синие и зеленые спектральные формы mKate2 существуют еще до «фотоактивации». Время жизни флуоресценции коротковолновых форм, как и общая интенсивность флуоресценции увеличивается при фотообесцвечивании красной формы, тогда как спектр поглощения практически не изменяется. Изменение формы спектра поглощения вместе с ростом вклада флуоресценции коротковолновых форм происходит после добавления универсального восстановителя дитионита независимо от облучения. Мы полагаем, что в клетках могут образовываться несколько спектральных форм белка, и, несмотря на мономерность mKate2, его концентрация в клетке достаточно высока для переноса энергии между отдельными хромофорами. Таким образом, механизм «фотоконверсии» mKate2 аналогичен «позеленению» тетрамерного белка DsRed: в растворе которого изначально присутствует фракция зеленых белков, однако их флуоресценция маскирована резонансным переносом энергии на красные хромофоры; при обесцвечивании последних интенсивность флуоресценции белков с зеленым хромофором увеличивается. Наша работа показывает необходимость исследования фотоактивности флуоресцентных белков на уровне отдельных молекул и их ансамблей.