ИСТИНА

Люциферазы светляков в качестве субстратов используют D-люциферин, АТР и кислород. Рекомбинантные клетки, продуцирующие люциферазу светляков, были получены нами и использованы в качестве тест-систем для регистрации изменений содержания АТР и люциферазы под действием эффекторов. Благодаря высокой активности и абсолютной специфичности к АТР, люциферазы светляков широко используются в тест-системах для детекции АТР - маркера жизнеспособности клетки. Благодаря прямой пропорциональности между содержанием АТР и количеством жизнеспособных клеток в исследуемых образцах, по снижению уровня АТР в присутствии различных стрессовых агентов (излучение, нагревание, добавки токсинов, антибиотиков) люциферин-люциферазный метод позволяет быстро детектировать изменения во внутриклеточных процессах, связанных с синтезом АТР. Тест-система на основе рекомбинантных клеток Е.cоli, продуцирующих термостабильную люциферазу светляков, была использована для изучения действия мембранно-активного антибиотика, колистина, на живые клетки Е.cоli. Анализ полученных зависимостей содержания люциферазы внутри (Аin) и вне (Аex), а также концентрации АТР внутри (АТРin) и вне (АТРex) клеток от концентрации колистина и длительности инкубации в питательной среде LB и физрастворе показал, что с ростом концентрации колистина и длительности инкубации Аin и АТРin быстро снижались, в то время как Аex росло благодаря увеличению проницаемости цитоплазматической мембраны, достигая предельной величины ~30% от исходной величины АТРin. Деградация же 70 % АТРin была объяснена тем, что колистин, проникая внутрь микробной клетки, дезорганизует систему синтеза АТР, что приводит к гибели клетки. Сравнение АТРin и АТРex при инкубации клеток в питательной среде и в физрастворе в отсутствие и в присутствии колистина показало, что более сильный бактерицидный эффект колистин оказывает на растущие, метаболически активные клетки, в то время как не растущие клетки, лишенные питания, оказываются более устойчивыми к действию антибиотика. Клетки НЕК293, транзиентно трансфицированные плазмидой pсDNALuc, экспрессирующей люциферазу светляков, были использованы для изучения действия на них мембранно-активного агента - дигитонина, образующего комплексы с холестерином клеточных мембран, что приводит к образованию пор и высвобождению внутриклеточных компонентов в реакционную среду. Разработанная биолюминесцентная методика непрерывного слежения за данным процессом позволила в режиме реального времени регистрировать кинетические кривые накопления во внеклеточном пространстве люциферазы и АТР в присутствии дигитонина. При концентрации ≤ 0,02 мМ дигитонина наблюдался длительный период индукции, при этом белок не вытекал из клеток, но появлялись небольшие поры, проницаемые для низкомолекулярных соединений (АТР). При повышении концентрации до 0,05 мМ индукционный период сокращался, быстро росла концентрация высвобождаемой люциферазы за счет образования крупных пор. Дигитонин наиболее токсичен для клеток при ≥ 0,08 мМ, когда период индукции.исчезает, и быстро достигается максимальная концентрация высвобождаемых белков. Работа выполнена в рамках госбюджетной темы МГУ АААА-А21-121011290089-4.