ИСТИНА

Анализ литературных данных показал, что стандартно используется РАМО с His6 на С-конце аминокислотной последовательности, отделенных специальным эпитопом. Поскольку известно, что введение и положение His6 может оказывать влияние как на каталитические свойства фермента, так и на его стабильность, целью данной работы было изучение вариантов PAMO c различным положением His6. Ранее в нашей лаборатории были получены плазмиды с генами, кодирующие фермент с His6 на N-конце (PAMO N), на С-конце (PAMO S), и на С-конце, отделенной специальным эпитопом (PAMO L). В рамках данной работы проведена оптимизация условий культивирования и очистка трех мутантных форм PAMO и показано что уровень экспрессии PAMO N в 3-5 раз выше, чем у ферментов с His6 на С-конце. Были измерены каталитические константы и константы Михаэлиса по NADPH и бензилацетону. Показано, что каталитические константы PAMO S и PAMO L совпадают с литературными данными для PAMO L, ранее полученной в другой системе экспрессии. В случае PAMO N наблюдается небольшое (на 15%) уменьшение каталитической константы. Константы Михаэлиса по NADPH в пределах погрешности совпадают с литературными данными, а для констант по бензилацетону наблюдается увеличение в 20 раз. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Москвы в рамках научного проекта № 19-34-70036.