ИСТИНА

Введение. С момента открытия в 1943 г. и до настоящего времени, аминогликозидные антибиотики сохраняют свое значение как эффективные средства лечения инфекций, вызываемых преимущественно грамотрицательными микроорганизмами, и не имеют альтернативы при борьбе с высокоустойчивыми штаммами. На сегодняшний день одним из наиболее используемых препаратов этого класса является гентамицин. Однако, его практическое применение, так же как и применение других аминогликозидных антибиотиков, сильно ограничено его высокой токсичностью по отношению к тканям почки и внутреннего уха. Мишенями токсического действия гентамицина являются эпителий проксимальных канальцев и наружные волосковые клетки Кортиевого органа. В клетках обоих типов повреждающее действие гентамицина связано с индукцией окислительного стресса и последующей гибелью клеток по некротическому или апоптотическому пути. Ряд данных позволяет предполагать, что ключевую роль в токсичности гентамицина играет его влияние на митохондриальный ретикулум. Так, гентамицин способен стимулировать митохондриальную продукцию перекиси водорода, а дисфункция митохондрий является самым ранним признаком гентамициновой нефротоксичности, предшествующим морфологическим и функциональным изменениям почки. Кроме того, ототоксичность гентамицина in vitro может быть обращена при использовании антиоксидантов или веществ, предотвращающих индукцию неспецифической проницаемости митохондрии (НПМ). Таким образом, можно предположить, что соединения, предотвращающие развитие окислительного стресса и нормализующие работу митохондрий, могут являться универсальными защитными агентами против гентамициновой нефро- и ототоксичности. Целью данной работы было исследовать возможность предотвращения гентамициновой токсичности при помощи митохондриально-адресованного антиоксиданта 10-(6'-пластохинонил)децилродамина-19 (SkQR1), агониста δ-опиоидного рецептора даларгина и хлорида лития, а также выяснить роль сигнальных путей ишемического прекондиционирования (ИПК) в защитном действии, реализуемом данными веществами. Результаты. Системное введение гентамицина крысам (в/б 160 мг/кг/сут) в течение 6 дней приводило к ярко выраженной острой почечной недостаточности (ОПН). На 7-е сут эксперимента креатинин крови возрастал с 61±2 мкМ до 248±39 мкМ по сравнению с контрольными животными, а содержание эритропоэтина в почке уменьшалось в 2 раза. К 20-м сут погибало 39% животных. При в/б введении SkQR1 в дозе 100 нмоль/кг за три часа до каждой инъекции гентамицина концентрация креатинина в крови крыс на 7-е сут уменьшалась до 154±27 мкМ, а содержание эритропоэтина в почке увеличивалось до 86% от контрольных значений. На 20-е сут опыта наблюдали снижение смертности до 18%. На 7-е, 10-е, 13-е и 20-е сут эксперимента проводили оценку остроты слуха при помощи неврологического теста, основанного на рефлексе Прейера (таблица). У животных, подвергшихся действию гентамицина, наблюдали снижение слуха, прогрессивно нараставшее в течение эксперимента. У животных, получавших одновременно с антибиотиком митохондриально-адресованный антиоксидант, ототоксичность начинала проявляться только на 10-е сут и была менее выраженной. Увеличение длительности курса SkQR1 с 6 до 12 сут полностью нивелировало токсичность антибиотика. При введении SkQR1 ин¬тактным животным было обнару¬жено, что митохондриально-адре¬сованный антиоксидант активи¬рует сигнальные пути ишемиче¬ского прекондиционирования. Через 3 ч после в/б инъек¬ции содержание эритропоэтина в почке увеличивалось в 1,7 раза, а через 24 часа в 2 раза увеличива¬лось содержание фосфорилиро¬ванной формы 3β-изоформы киназы гликоген синтазы (GSK-3β). Кроме того, мы обнаружили, что введение интактным животным хлорида лития (в/б 30 мг/кг) или агониста δ-опиоидного рецептора даларгина (в/б 50 мкг/кг) так же приводит к фосфорилированию GSK-3β в почке. Профилактическое введение хлорида лития (в/б 30 мг/кг) или даларгина (в/б 50 мкг/кг) за 3 ч до каждой инъекции гентамицина предотвращало развитие ОПН: концентрация креатинина уменьшалась с 362±41 мкМ у гентамициновых животных до 207±32 мкМ и 225±44 мкМ при лечении даларгином и хлоридом лития, соответственно. Обсуждение. Предполагается, что в основе нефро- и ототоксичности гентамицина лежат близкие по структуре механизмы. Антибиотик вызывает гиперпродукцию активных форм кислорода (АФК) в митохондриях клеток, что приводит к индукции НПМ, в свою очередь, вызывающую гибель клеток по апоптотическому или некротическому сценарию. Потеря функциональных клеток органа становится в итоге причиной почечной недостаточности или снижения слуха. В пользу именно такого развития событий говорят данные Walker и Shah, наблюдавших увеличение образования перекиси водорода в почечных митохондриях под действием гентамицина, и Morales и соавт., показавших, что внутрибрюшинное введение гентамицина крысам приводит к открытию поры неспецифической проницаемости в митохондриях почки, а антидиабетический препарат метформин предотвращает развитие почечной недостаточности и индукцию НПМ. В то же время в исследовании Dehne и соавт. были получены свидетельства участия НПМ в гентамицин-индуцированной гибели нейросенсорных клеток улитки in vitro, а в работе Jung и соавт. было продемонстрировано защитное действие метформина и на модели ототоксичности. НПМ играет ключевую роль в выживании или гибели клетки в условиях окислительного стресса. Структура комплекса поры, обеспечивающей НПМ, до сих пор точно не определена, однако, накоплено множество данных о её регуляции. Одним из важнейших участников этого процесса является GSK-3β. Фосфорилирование серина-9 данного фермента приводит к его инактивации. В свою очередь, снижение активности GSK-3β связано со снижением чувствительности порового комплекса НПМ к триггерам, её индуцирующим. Показано, что GSK-3β является конечным эффектором различным сигнальных путей, связанных с толерантностью к ишемии и окислительному стрессу. В рамках данной схемы, предотвращение гентамициновой токсичности может быть реализовано на двух этапах: нейтрализация АФК и предотвращение индукции НПМ. Использованный в нашей работе митохондриально-адресованный антиоксидант SkQR1 сочетает в себе оба подхода. Данная молекула является мощным прямым антиоксидантом, при этом избирательно накапливающимся в митохондриях. С другой стороны, как нами было показано, SkQR1 индуцирует сигнальные защитные пути, приводящие к фосфорилированию GSK-3β. Введение антиоксиданта за 3 часа до каждой инъекции гентамицина эффективно предотвращало, как нефро- так и оттотоксическое действие антибиотика. Эти данные, полученные in vivo, являются сильными аргументами в пользу того, что токсическое действие гентамицина в тканях внутреннего уха и почки развивается по одному и тому же молекулярному механизму. В тоже время, можно предположить, что отопротекторное действие SkQR1 реализуется опосредованного, через сохранение выработки эритропоэтина почкой в течение курса гентамицина. Действительно известно, что эритропоэтин способен предотвращать оттотоксическое действие аминогликозидных антибиотиков. Однако в то же время, известно, что защитное действие этого гормона на клеточном уровне может реализовываться через его антиоксидантное действие и индукцию сигнальных путей ИПК, что не противоречит нашей гипотезе. Защитное действие хлорида лития и гексапептида даларгина – веществ, не обладающих прямым антиоксидантным действием, но увеличивающих фосфорилирование GSK-3β – подтверждает исключительную важность НПМ в патогенезе гентамициновой токсичности. Эти данные так же показывают, что активация сигнальных путей ИПК является многообещающей областью для разработки нефропротекторных препаратов. На основании полученных нами данных можно с уверенностью предполагать, что митохондриальная дисфункция, возникающая как следствие гиперпродукции АФК, играет ключевую роль в реализации как нефро-, так и ототоксического действия аминогликозидных антибиотиков, а специфичное предотвращение окислительного стресса в митохондриях или индукция сигнальных путей ИПК является перспективным направлением разработки подходов к нивелированию аминогликозидной токсичности. Работа частично поддержана грантами РФФИ 11-04-01307 и 11-04-00771.