ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
В настоящее время ферменты находят все более широко применение на практике в качестве биокатализаторов в процессах тонкого органического и хирального синтеза, создания высокочувствительных биосенсоров. Однако природные источники не удовлетворяют большинству задач в силу низкой каталитической эффективности против неприродных молекул, несовпадением рН-оптимумов активности и стабильности требованиям конкретного процесса или условиям анализа. Ферменты также используются как мишени при разработке лекарств против патогенных микроорганизмов. Особенно это актуально для борьбы с биопленками патогенов, против которых широко используемые антибактериальные препараты оказываются неэффективными. В силу высокой стоимости большинства ферментов для снижения их себестоимости в общей стоимости процесса необходимо получать биокатализаторы с заданными свойствами, которые наиболее оптимальны для конкретной задачи. К сожалению, классические методы скрининга источников ферментов, а также простое применение методов неупорядоченного и направленного мутагенеза очень часто не позволяют решать поставленные задачи с высокой эффективностью и малой трудоемкостью. В данном докладе будут рассмотрены методы начального поиска интересующих ферментов на основе анализа геномов с последующей инженерией с помощью рационального дизайна. На основании данного подхода были клонированы гены формиатидегидрогеназы (ФДГ) из дрожжей и патогена. Ферменты были закристаллизованы и была определена их 3D структура. Новые ФДГ продемонстрировали улучшенные активность или каталитическую эффективность, более высокую термостабильность по сравнению с ранее опиcанными ФДГ. Структура ФДГ из патогенна также была взята за основу для поиска лекарств против биопленок патогенна. Также из дрожжей были клонированы три гена оксидазы D-аминокислот (DAAO), одна из которых имела самую высокую активность с D аланином, а вторая оказалась новым, ранее не описанным типом DAAO. Вторая DAAO является оптимальной для создания биосенсоров на D аминокислоты, играющих ключевую роль в регуляции нервной деятельности. Второй подход включает создание гибридных белков на основе ФДГ и моноокисгензы. Объединение этих ферментов в одну цепь приводит к сближению активных центров и более эффективному переносу субстратов и продуктов между их активными центрами. В случае фьюжена ФДГ и цитохром Р450 монооксигеназы ВМ3 (используется для синтеза лекарств) было проведено моделирование общей структуры ВМ3 отдельно и двух вариантов слитого белка, общий размер которого составил 1200 х 2 = 2400 аминокислот. Получены четыре генно-инженерные конструкция (ФДГ1-ВМ3, ВМ3-ФДГ1, ФДГ2-ВМ3, ВМ3-ФДГ2), проведена экспрессия гибридных ферментов в активном виде. На ряде субстратов ВМ3 была показана более высокая эффективность фьюженов по сравнению со смесью отдельных ферментов. Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты 17-04-01469, 17-04-01662, 17-04-01487, 18-34-00594 и 18-34-20098), гранта РФФИ и Правительства Москвы 19-34-70036, РНФ (грант 18-74-00146) и DAAD (стипендия ПДП).