ИСТИНА

Исследование экофизиологических особенностей конкретных микроорганиз- мов занимаются давно и широко во всём мире. По существу эти исследования представляют собой аутэкологическую характеристику изучаемых микроорганиз- мов. Как правило, проводится исследование in vitro (в лабораторных условиях) в градиенте силы влияния абиотических (поллютанты, температура и т.д.) и биоти- ческих (антибиотики, токсины, биологические жидкости и т.д.) на те или иные кине- тические (ростовые) характеристики микроорганизмов. Исходя из найденной зави- симости «доза-эффект» определяется оптимум и пессимумы изучаемых биомет- рических параметров микроорганизмов (максимальная удельная скорость роста, урожайность микроорганизмов на среде, радиальная скорость роста колоний и т.д.). Термин «экофизиология сообщества микроорганизмов» напротив не распро- странён в научном мире и не имеет чётко определения. Под экофизиологической характеристикой микробного сообщества мы понимаем изучение физиологиче- ского разнообразия комплекса микроорганизмов, преобладающего среди его чле- нов экологической стратегии и физиологического состояния. Под физиологическим разнообразием сообщества мы понимаем способность его членов расти и размно- жаться в различных физиологических условиях среды, таких как температура, соленость, окислительно-восстановительный потенциал и т. д. Трофическое раз- нообразие -способность его членов использовать различные источники пищи (способность расти на полимерах, осуществлять тот или иной тип фотосинтеза и т. д.). Функциональное разнообразие - способность членов сообщества выполнять свои экологические функции (разложение растительных остатков, снабжение эко- системы азотом с помощью азотфиксации, вступать в симбиоз с растениями или вызывать заболевания растений или животных и т. д.). Трофическое разнообра- зие, являющееся частным проявлением физиологического разнообразия. Под экологической стратегией микроорганизма мы понимаем его стратегию роста, ха- рактеризуемую кинетическим параметрами развития микроорганизма. Мы придер- живаемся традиционной схемы разделения микроорганизмов в трёхмерном про- странстве факторов К-, г- и L-стратегий [4]. Термин «физиологическое состояние микроорганизмов» часто понимается как совокупность всех наших знаний о биохи- мических особенностях микроорганизмов [5]. Поэтому любое не связанное с трансформацией генома изменение биохимических свойств микроорганизма мож- но считать изменением физиологического состояния. Подобное представление термина делает его непригодным для конкретных количественных измерений фи- зиологического состояния. Мы придерживаемся другой концепции [4], согласно которой физиологическое состояние - это кинетическая переменная величина, характеризирующая степень адаптированности микроорганизма к росту в среде обитания, определяемая из кривой роста микроорганизмов на среде. Перед современной биоиндикацией стоят три задачи. Первая - разработать методы более дешёвого и быстрого определения физико-химических параметров окружающей среды, чем химическими и физическими методами исследования. Мы полагаем, что развитие инструментальной базы химических и физических методов исследования в 21 веке таково, что делает малоперспективным серьезную биоин- дикацию гранулометрического состава почв, засолённости, кислотно-основных свойств по биологическим объектам, тем более столь ненадёжным как микроорга- низмы. Вторая задача - биоиндикация того, что не может быть измерено другими способами: палеореконструкция или оценки последствий быстрых нарушающих воздействий (например загрязнений), которые исчезают очень быстро и бесслед- но, оставляя только нарушения в биоте, по которым мы только и можем судить о произошедшем событии. В этой области первенство на наш взгляд должно при- надлежать зоологам и ботаникам, так как животные и растения имеют большее время генерации, чем микроорганизмы и последствия нарушений сохраняются дольше в фито- и зоо- ценозах (не говоря уже об сохранности ископаемых остат-ков- используемых в паленологическом, ризоподном анализах и т.д.). Третья зада- ча - это биооценка состояния окружающей среды. В этом аспекте биоиндикации микроорганизмы должны занимать ключевую роль, так как от них зависит поддер- жание гомеостаза всей экосистемы. Не смотря на свою важность микроорганизмы - плохой объект биоиндикации. Широко известно, что по мере уменьшения размер- ной группы животных в биоиндикации становится эффективным использовать не индикаторные «верные» виды животных, а весь таксоцен: комплекс почвенных коллембол, нематод или раковинных амёб и т.д.. Поэтому мы считаем оправдан- ным использовать для биоиндикации ту или иную широкую группу микроорганиз- мов - грибы, бактерии, водоросли. Одна из целей почвенного микробиолога - вы- яснить, какой микроорганизм и с какой скоростью осуществляет тот или иной про- цесс непосредственно в почве. Достичь этого можно структурно-функциональной характеристикой микробного сообщества. Под структурной характеристикой пони- мается таксономический состав почвенного микробного сообщества. Функцио- нальная характеристика включает в себя информацию о протекании микробиоло- гических процессов в почве. В почвенной микробиологии своим исконным, а не заимствованным из других областей микробиологии, методологией исследования сообщества является идея почвенных добавок, предложенная независимо двумя основоположниками почвенной микробиологии С.Н. Виноградским [1] и М. Бейе- ринком. Суть методологического подхода к исследованию микробного комплекса заключается во внесении в почву в контролируемых условиях почвенных микро- космов того или иного вещества и отслеживания различными микробиологически- ми методами реакции на этой воздействие в динамике - в ходе восстановительной микробной сукцессии. Этот подход был успешно реализован в виде различных методов: метод инициированного амилолитического сообщества, метод определе- ния биомассы микроорганизмов в почве по субстрат-индуцированному дыханию, метод определения потенциальной активности азотфиксации и денитрификации в почве, аппликационный метод и во многих других [3]. При этом непосредственным объектом исследования выступает не конкретные виды микроорганизмов, а всё инициированное нарушение микробное сообщество. Основываясь на этом подхо- де и перечисленных выше методах, взяв за основу метод мультисубстратного тестирования [2], мы создали новый комплексный структурно-функциональный метод характеристики микробных популяций в природе, для экофизиологической характеристики сообществ. Суть метода заключается в изучении микроорганизмов in situ не на уровне таксонов или крупных функциональных групп, а на основе ки- нетики роста микробных ассоциаций, возникающих в селективных условиях в жидких питательных средах, после инокуляции этих сред суспензией микроорга- низмов, выделенных из почв. Наша рабочая гипотеза заключается в том, что воз- никшие после инокуляции сред ассоциации микроорганизмов отражают экофизио- логические свойства материнского микробного сообщества. Физиологическое раз- нообразие сообщества мы оцениваем по доле селективных сред, на которых в заданных условиях смогли сформироваться активно растущие ассоциации. Други- ми словами, по физиологическому разнообразию ассоциаций in vitro, мы судим о физиологическом разнообразии сообщества in situ. В жидких селективных средах развиваются периодические (накопительные) смешанные культуры микроорганиз- мов, которые мы описываем авторской «комплексной моделью периодической культуры», разработанной для чистой культуры микроорганизмов [6]. Модель опе- рирует параметром среды s0 - начальной концентрацией ростового субстрата s (г/л) и параметрами культуры: Х0 - начальное значение концентрации культуры х в питательной среде; t™ - значение времени t когда кончается лаг-период в разви- тии культуры ч; ym - максимальное значение удельной скорости роста |j, ч-1; р0 - начальное значение переменной физиологического состояния растущей культуры р; у = 100+ln(po) - метаболическая готовность культуры к росту на питательной среде; константа полунасыщения (г/л) Кр = s при р = 0.5pm, где pm = 1 - максималь- ное значение р; Y - экономический коэффициент роста микроорганизмов на пище- вом субстрате, Y = (xm-x0)/s0, где xm - максимальная концентрация культуры; am - максимальная удельная скорость отмирания, ч-1; Тотм - время начала экспоненци- ального отмирания, ч; по - значение переменной физиологического состояния п отмирающей культуры в момент начала экспоненциального отмирания. П р и t < Тотм,. dx s ds их dp s — = их; и = UmP——; х = ; ~г = итр(— Р) dt K p + s dt Y dt K p + s При t> Тотм, dx da dv -г = -ax; -г- = -a mv; — = -oM1 az dr ат - v) Экологическую стратегию ассоциаций мы количественно определяем по величи- нам параметров ym, Кр, ym/Кр, Y, am, по., характеризующие разные участки кривой роста и отмирания периодической смешанной культуры. Наша рабочая гипотеза - преобладающие среди ассоциаций стратеги роста, отражают преобладающие стратегии роста среди членов исходного сообщества. Физиологическое состояние микроорганизмов в почве, понимаемое нами как метаболическая готовность к рос- ту, определяется по значениям параметра у, рассчитанных для ассоциаций. Техническая реализация метода на сегодняшний день следующая [6]. Все процедуры проводят с соблюдением стерильности. Каждый раз при проведении анализа необходимо предусмотреть контроль на стерильность. Гомогенизацию и десорбцию микроорганизмов с твердых субстратов проводят в водной суспензии (1 : 5) в течение 20 мин при 2000 об./мин на встряхивателе "вортэкс" модель "Multi Reax" фирмы "Heidolph". Крупнодисперсные образцы предварительно измельчают. Рост грибов в суспензии подавляют добавлением антибиотика нистатина 0.05%. Для подавления бактерий - 0.25% хлорамфеникола. Избыток частиц субстрата удаляют центрифугированием при 3200 g 5 мин. Концентрацию и состав культиви- руемых микроорганизмов в исходном субстрате определяют высевом из суперна- танта на агаризованную глюкозо-пептонно-дрожжевую среду (каждый питательный компонент которой взят в концентрации 1 г/л) общепринятым способом [3], с опи- санием динамики появления колоний на чашках Петри в рамках «комплексной модели периодической культуры, описанной выше». Супернатант добавляют по 100 мкл в ячейки 96-луночной плоскодонной культуральной полистероловой план- шеты с крышкой, в которую уже внесен набор различных жидких питательных сред по 100 мкл. Состав жидких сред определяется задачами исследования. Желатель- но, чтобы среды были прозрачными, бесцветными или не меняли цвет при росте микроорганизмов. Чтобы не принять за рост на органическом веществе питатель- ной среды рост за счет побочных веществ инокулируемой суспензии исследуемого образца, необходим контрольный вариант питательной среды без ростового суб- страта. Питательные среды стерилизуют автоклавированием или фильтрованием через мембранные фильтры, с диаметром пор 0.22 мкм. Для предотвращения испарения воды из ячеек, планшет с боков закрывают лентой парафилм (parafilm). Планшет помещают в имунноферментный анализатор ("Sunrise" фирмы "Tecan"), который автоматически регистрирует рост микроорганизмов по оптической плотно- сти (рекомендуется длина света детекции 620 нм) в динамике, с периодическим встряхиванием планшеты. Для поддержания температуры прибор помещают в климатическую камеру или термостат. Температура определяется задачами экс- перимента, рекомендуется стандартная для почвенной микробиологии 25°С [3]. Измерение проводится то тех пор, пока во всех вариантах опыта не закончится рост (примерно 200-300 часов). По окончании роста из ячеек делают высев на агаризованные варианты сред ячеек или на глюкозо-пептонно-дрожжевую среду, чтобы выяснить, таксономический состав возникших в ячейках ассоциаций. Иден- тификацию микроорганизмов проводят современным молекулярно-генетическим методом на основе анализа нуклеотидной последовательности гена рибосомаль- ной РНК. По данным посева из ячеек строят калибровочное уравнение, позволяю- щее пересчитать оптическую плотность в концентрацию клеток микроорганизмов. Можно для построения калибровочного графика использовать микроскопию сус- пензий бактерий и грибов в ячейках, с последующим пересчётом на концентрацию биомассы в единице объёма. Концентрация микроорганизмов рассчитывается по формуле , С (t) = C0 + а х (OD620 (t) - OD6™ р°ста) где C(t) - концентрация микроорганизмов в момент времени t , Со-исходная концентрация клеток; OD620 (t) - оптическая плотность суспензии в момент времени t, OD н а ч а л а р ° с т а - оптическая плотность суспензии в момент начала реги- 620 страции роста прибором (порог чувствительности прибора порядка 106 клеток на мл суспензии), a - коэффициент пересчёта от оптической плотности к концентрации микроорганизмов в суспензии, для бактерий a =2.0±0.51109. Рост периодической смешанной культуры (ассоциации микроорга- низмов) в ячейках описывают комплексной моделью приведённой выше. В данном исследовании изучалось физиологическое разнообразие гидролитического блока бактерий и грибов, поэтому использовали жидкие селективные среды следующего состава: в разбавленную в 4 раза минеральную основу среды Чапека состава (г/л): NaNOa -0.5, К2НРО4 -0.25, MgSO4 • 7H2O - 0.12, KCl-0.12, приготовленную на водопроводной воде, вносился в концентрации 2.5 г/л в качестве единственного источника углерода биополимер животного, растительного и микробного происхо- ждения или их аналоги: целлюлоза, хитин, казеин, кератин, пектин, ксилан, декст- ран-500, твин 20, нуклеиновая кислота, агароза, инулин, крахмал. Таким образом в ядре синтрофных ассоциаций, формирующихся после инокуляции почвенной сус- пензией сред с полимерами, должны быть гидролитические грибы и бактерии, вокруг которых могут также развиваться копиотрофные бактерии и «микрофлора рассеивания» [4]. Объектами исследования выступали грибные и бактериальные аэробные, факультативно - анаэробные комплексы, культивируемые на традиционных пита- тельных средах. Исследовались торфянистая почва каменистой пустоши и мине- ральной почвы берега озера (холмы Ларсемана) и влажной долины (холмы Тала) в Антарктиде. Очёс и торф верховой торфяной остаточно эутрофной почвы, ото- бранной на территории Западнодвинского лесо-болотного стационара Института лесоведения РАН Тверская обл. Лиственная подстилка в лесополосе на террито- рии почвенного стационара МГУ, и почва под ней; серая лесная почва, пахотный горизонт (Московская область) содержимое кишечника и экскрементов двупарно- ногих многожек Cylindroiulus caeroleocinctus (Москва), Orthomorpha sp.1, Thyropygus sp. 1 , неописанный вид отряда Spirobolida. Всего было проанализировано 144 образца. Целью исследования было проверить принципиальную возможность устано- вить по экофизиологическим параметрам различия между микробными сообщест- вами различных почв с помощью формальных математических методов анализа. В задачи исследования входило: 1. проведение исследования экофизиологических параметров различных почв комплексным структурно-функциональным методом; 2. сравнение исследуемых сообществ многомерными методами анализа - кла- стерным, факторным анализом методом главных компонент, методом многомер- ного шкалирования и дискриминантным анализом. Для установления степени сходства исследованных бактериальных сооб- ществ вышеописанными методами исследовали параметр Y. В результате уда- лось разделить микробные сообщества различных местообитаний. Причём взаи- морасположение сообществ в многомерном пространстве кинетических парамет- ров было аналогичным в разных методах. Поэтому в качестве примера на рисунке приведены результаты анализа данных только методом главных компонент. Из рисунка следуют следующие выводы: 1. Микробные сообщества резко различных по свойствам почв различаются комплексным структурно- функциональным методом по экофизиологическим параметрам. Так в ряду сооб- щество кишечника - подстилка - очёс мха сфагнума - антарктические почвы на- блюдается снижение Y, что предположительно связано со снижение разнообразия гидролитических микроорганизмов в этом ряду. В неразнообразном комплексе гидролитиков просто не находится член, способный активно вырасти в заданных в эксперименте условиях жидких сред 2. Изменения свойств носят континуальный характер, и сильно зависит от погодных условий, что сильно затрудняет использо- вание данного подхода для задач биоиндикации. 3. Необходим поиск новых селек- тивных сред на роль кандидатов в список диагностических сред для культивирова- ния диагностических ассоциаций.