ИСТИНА

Инициация транскрипции является ключевым этапом экспрессии генов. У бактерий инициация происходит при участии холофермента РНК-полимеразы (РНКП) и включает этапы узнавания и плавления промотора, инициацию синтеза РНК, синтез коротких абортивных продуктов и уход с промотора. Несмотря на многолетние исследования, до сих пор мало известно о кинетике ухода РНКП с промотора, а также о влиянии на этот процесс транскрипционных факторов. Целью нашей работы является изучение процесса перехода от инициации к элонгации транскрипции с использованием недавно изобретенного метода молекулярных маяков, который позволяет в режиме реального времени детектировать образование и разрыв контактов РНКП с промотором. Мы получили мутации в районе fork-loop2 β-субъединицы (FL2) и районе 3.2 -субъединицы РНКП, которые потенциально могут влиять на процесс ухода с промотора. Район FL2 по структурным данным образует специфические контакты с остатком гуанина в +2 положении нематричной цепи ДНК в промоторном комплексе. Район σ3.2 проникает в активный центр и перекрывает путь выхода синтезируемого РНК-транскрипта. Мы показали, что мутации в этих районах влияют на соотношение абортивных и полноразмерных продуктов и, вероятно, изменяют скорость ухода с промотора. Для проверки этого предположения мы измерили кинетику ухода РНКП при инициации на разных промоторах – как дикого типа, так и с консенсусными -10 и -35-элементами. Было установлено, что наличие остатка гуанина в +2 положении промотора замедляет скорость перехода к элонгации, но это не связано с образованием специфических контактов с районом FL2. Транскрипционный фактор GreB увеличивает скорость ухода с некоторых промоторов. В то же время, мутации в районе σ3.2 затрудняют уход с промотора, причём GreB не только не способен супрессировать эффект мутации, но, наоборот, дополнительно уменьшает скорость перехода к элонгации. Такой же эффект наблюдается при использовании в качестве затравки динуклеотидного РНК-праймера, лишенного 5’-трифосфатной группы. Полученные данные подтверждают, что район σ3.2 играет важную роль в разрыве контактов РНКП с промотором, и показывают, что 5’-концевой трифосфат способствует успешному удлинению РНК-транскрипта в ходе инициации транскрипции. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-34-00824.