ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
L-Аспарагиназа, относится к классу треониновых амидогидролаз и катализирует реакцию гидролиза аспарагина до аспарагиновой кислоты, что делает возможным её применение в терапии различных видов миелом и острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ). Однако медицинское использование фермента ограничено его неустойчивостью в кровотоке и повышенной имунногенностью, нередко ведущей к анафилактическому шоку. Поэтому актуальна задача разработки новых высокоэффективных L-аспарагиназных препаратов пролонгированного действия. Для решения данной задачи нами предложен новый подход к регуляции каталитических свойств ферментов, используемых в медицинской практике, который основан на образовании ковалентных конъюгатов фермента с разветвленными сополимерами хитозана (хитоПЭГилирование) и гликоль-хитозаном. Эффективность метода исследовали на примере нового рекомбинантного препарата L-аспарагиназы из Erwinia carotovora (EwA). Данный препарат является иммунологически отличным от используемых в медицинской практике препаратов L-аспарагиназы из E. coli, что определяет перспективы его использования в качестве альтернативы при развитии гиперчувствительности к препарату из E. coli в результате длительного лечения или при индивидуальной непереносимости первичного препарата. Полиэлектролитная природа модифицированных хитозанов способствует их многоточечному электростатическому взаимодействию с поверхностью белка, что позволяет модулировать каталитические свойства фермента, в том числе за счет сдвига рН оптимума активности фермента в область физиологических значений рН. Для определения каталитических параметров модифицированных препаратов разработаны новые методики на основе кислотно-основного титрования и КД-спектроскопии, позволяющие качественно определять каталитические параметры L-аспарагиназных препаратов различного состава. Что было невозможно до настоящего времени. Оптимизация молекулярной архитектуры и состава конъюгатов приводит к увеличению в 4–6 раз каталитической эффективности фермента (kcat/Km) в отношении L-аспарагина при физиологических условиях. L-глутаминазная активность, отвечающая за побочные эффекты при L-аспарагиназных препаратов, в случае конъюгатов снижена в 4-5 раз по сравнению с нативным ферментом. Установлено, что конъюгирование повышает термостабильность фермента, снижая его константу инактивации в 2 раза. В опытах in vitro показано, что конъюгаты EwA с ПЭГ-хитозаном проявляют более высокую противоопухолевую активность (на 20-40%) по сравнению с нативным ферментом в отношении клеток хронического миелоидного лейкоза человека К562 и клеток аденокарциномы молочной железы MCF7. При этом удельная активность фермента в конъюгатах в 4-6 раз выше, т.е. при той же дозе (в МЕ) в препарате содержится в 4-6 раз меньше белка, чем в случае нативного фермента, что значительно снижает иммуногенность препарата. Полученные результаты открывают перспективы создания L-аспарагиназных препаратов с улучшенными фармакокинетическими свойствами. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 14-04-00325Аб гранта Правительства РФ № 11G34.31.0004 и программы развития МГУ