ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Работа посвящена исследованию молекулярных механизмов транскрипции и трансляции ретротранспозона L1. Многочисленные копии этого мобильного элемента занимают более 17% хромосомной ДНК человека. L1 кодирует уникальную бицистронную мРНК, которая является одновременно транспозиционным интермедиатом и матрицей для синтеза двух белков ретротранспозона. Синтез мРНК L1 направляется внутренним промотором, расположенным в 5’-нетранслируемой области мобильного элемента. Этот необычный промотор не содержит ни одного из классических промоторных элементов (TATA-бокс, Inr, DPE, BRE, MTE), и механизм его работы неизвестен. До сих пор считалось, что ключевые детерминанты, отвечающие за работу этого промотора, локализованы в первых 100 нт 5’-НТО L1 (т.н. «минимальный промотор» - см., напр., новейший обзор Babushok and Kazazian, 2007), однако наши данные однозначно свидетельствуют, что такое представление ошибочно: для транскрипционной активности ретротранспозона L1 наибольшую значимость имеет вовсе не район «минимального промотора», а внутренняя область 5`-НТО (+400 - +580). На этом участке сосредоточены множественные сайты связывания факторов транскрипции, и он способен стимулировать активность «минимального промотора» ретротранспозона, будучи удален от него на расстояние более 2.5 т.н.о. Таким образом, внутренний район 5’-НТО играет роль уникального внутригенного энхансера. Полученные нами данные позволяют провести аналогии между организацией промоторной области ретротранспозона L1 человека и структурой регуляторных участков других LINE-ретротранспозонов – в частности, хорошо изученных промоторов мобильных элементов беспозвоночных (прежде было принято считать, что структура промоторных областей элементов этих двух групп принципиально различна). Кроме того, мы показали, что в отсутствие «минимального промотора» внутренний район 5’-НТО способен самостоятельно направлять транскрипцию. Данный факт позволяет предположить, что первичный активаторный комплекс, необходимый для привлечения РНК-полимеразы II, собирается именно на внутреннем участке 5’-НТО, и только после этого полимераза либо оказывается в районе «минимального промотора», либо (в случае его отсутствия) инициирует с ближайших криптических сайтов. Сходная модель предложена недавно для промотора гена CD80 мыши: активаторный комплекс в этом случае собирается на участке, лежащем в 600 нт «выше» области старта (George et al, 2006). В случае же L1 наша модель позволяет объяснить механизм инициации транскрипции с полностью внутренних промоторов, который до сих пор остается загадкой. Материалы данной работы были опубликованы нами в отечественном журнале «Молекулярная биология» в 2007 году. Кроме того, работа продолжается, и сейчас мы планируем также публикацию на эту тему в зарубежном издании. Основная же часть исследования была посвящена изучению механизмов трансляции мРНК L1. На этом пути мы столкнулись с рядом серьезных методических трудностей – а именно, критический анализ двух ключевых методов, которыми пользуются большинство исследователей эукариотической трансляции во всем мире (трансляция in vitro в лизате ретикулоцитов кролика и ДНК-трансфекция клеток культуры бицистронными конструкциями) позволил заключить, что получаемые с помощью них результаты зачастую являются артефактами. Так, лизат ретикулоцитов кролика (ЛРК), не подходит для мРНК, имеющих протяженные однонитевые участки с внутренними AUG-кодонами. Мы показали, что такие мРНК способны к аберрантной инициации трансляции на неаутентичных AUG-кодонах. Более того, даже на аутентичных стартовых кодонах, если они находятся внутри протяженных А-богатых однонитевых участков, значительная доля рибосом инициирует по такому же механизму неспецифической внутренней посадки. Это делает невозможным корректный анализ влияния тех или иных модификаций структуры мРНК (делеций, ввода AUG-кодонов, шпилек) на эффективность её трансляции, а также во многих случаях приводит к ложноположительным результатам тестов на наличие IRES-элементов методом бицистронных конструкций (критерием «истинности» или «ложности» результатов в данном случае являются результаты, полученные при трансляции тех же мРНК в системе in vivo при РНК-трансфекции клеток культуры). Что же касается экспериментов in vivo, то метод ДНК-транфекции оказался непригоден для изучения трансляции по причине слишком большого вклада криптической промоторной активности (неадекватность метода ДНК-трансфекции сейчас широко обсуждается в среде специалистов по эукариотической трансляции). Взамен этих методов мы разработали новые подходы, лишенные упомянутых недостатков. Для изучения механизма трансляции мРНК L1 in vitro мы применили новую бесклеточную систему «ЛРК+HeLa» (эта система описана в нашей статье, опубликованной в журнале «Молекулярная биология» в 2006 году). Для анализа трансляции L1 in vivo мы одними из первых в мире стали использовать трансфекцию клеток искусственно синтезированными кепированными полиаденилирован¬ными мРНК. С помощью этих новых подходов было однозначно показано, что инициация трансляции обоих цистронов L1 осуществляется по кеп-зависимому механизму. Данный факт является нетривиальным и расходится с предсказаниями, сделанными ранее в литературе рядом зарубежных исследователей (см., напр., обзор Ostertag and Kazazian, 2001): дело в том, что сам факт наличия в мРНК двух цистронов, как правило, предполагает присутствие сайта внутренней посадки рибосомы (IRES), направляющего синтез второго белка; кроме того, длинная (более 900 нт) GC-богатая 5’-НТО, содержащая к тому же две коротких uORF, по существующим представлениям должна делать трансляцию мРНК L1 крайне неэффективной – а это в случае первого цистрона L1 было бы нелогично, ведь он кодирует структурный белок РНП-частицы L1, который необходим ретротранспозону в больших количествах. Тем не менее, в ходе нашего исследования выяснилось, что мРНК L1 не содержит IRES-элементов. Трансляция второго цистрона происходит по механизму ре-инициации, причем по непонятным пока причинам слабо зависит от AUG-кодона. Эффективность этой ре-инициации крайне невысока. В то же время эффективность трансляции первого цистрона, напротив, оказалась неожиданно высокой, сходной с таковыми для мРНК с короткими 5’-НТО (например, мРНК бета-актина). Значительная (в два порядка) разница в уровнях инициации трансляции первого и второго цистронов мРНК L1 обеспечивает нужное соотношение количеств закодированных в них белков (структурного белка мРНП и обратной транскриптазы, соответственно). Обнаруженный факт высокоэффективной кеп-зависимой инициации трансляции первого цистрона является особенно интересным, поскольку он совершенно не укладывается в рамки классической «сканирующей» модели. Путем введения дополнительных uAUG-кодонов нам удалось показать, что длинная структурированная 5’-НТО мРНК L1 полностью «просматривается» (сканируется) инициирующей рибосомой, однако это нисколько не снижает эффективности работы такого лидера. Делеционный анализ не выявил в составе 5’-НТО никаких важных детерминант, которые позволили бы говорить о каком-то особом механизме (например, «шунтировании» центральной части 5’-НТО), поэтому наши результаты становятся очередным поводом для пересмотра устоявшихся представлений о пути кеп-зависимой инициации трансляции и факторах, влияющих на эффективность этого процесса. Побочным, но не менее важным результатом нашей работы являются новые критерии, разработанные нами для оценки наличия/отсутствия в той или иной мРНК IRES-элементов. Мы фактически были первыми, кто критически подошел к существующему на данный момент правилу – сравнивать между собой эффективность трансляции второго цистрона в разных бицистронных конструкциях (в одной из них – отрицательном контроле – в межцистронном положении находится полилинкер плазмиды, в другом – положительном контроле – какой-либо из уже изученных IRES-элементов, а в третьей – в опытной конструкции – в межцистронное положение помещена изучаемая последовательность). Такой подход дает результаты, в оценке которых есть изрядная доля субъективности: многое зависит от того, какой IRES взят в качестве положительного контроля (поскольку многие даже «бесспорные» IRES’ы являются очень слабыми, они иногда отличаются от отрицательного контроля всего лишь в несколько раз). К тому же в таком опыте мы видим не то, по какому механизму в клетке фактически транслируется мРНК с данным лидером, а то, насколько эффективную внутреннюю инициацию она могла бы обеспечить. Использование данного критерия привело к открытию десятков IRES-элементов в клеточных мРНК, многие из которых по прошествии нескольких лет после открытия уже пришлось «закрыть» (и мы, и многие наши коллеги уверены, что таких «ложных клеточных IRES’ов» вообще большинство!). Взамен вышеописанного критерия мы предложили два новых: (1) сравнивать эффективность трансляции, направляемой изучаемым лидером в контексте бицистронной мРНК, с таковой в контексте моноцистронной и (2) оценивать эффект m7G-кепирования на трансляцию моноцистронной мРНК. Оба этих варианта легко использовать в варианте РНК-трансфекции. Вполе возможно, что новые критерии заставят пересмотреть представления о наличии IRES-элементов во многих длинных и сложно устроенных лидерах клеточных мРНК. Результаты, касающиеся механизмов трансляции обоих цистронов мРНК ретротранспозона L1, а также новые критерии оценки IRES’ной активности в 5’-НТО мРНК были опубликованы нами в престижном международном журнале «Molecular and Cellular Biology» (импакт-фактор-2003 – 8.840).