ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Интеграза вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) является одним из ключевых ферментов вируса, который осуществляет интеграцию, т.е. встраивание вирусной ДНК в ДНК зараженной клетки. Известно, что в процесс интеграции кроме интегразы вовлечены различные клеточные белки, среди которых коактиватор транскрипции LEDGF/р75. Он связывается с интегразой ВИЧ-1, играет критическую роль в процессе интеграции ДНК ВИЧ-1 и необходим для эффективной репликации вируса. В связи с этим, невозможно понять механизм интеграции без исследования взаимодействий ИН с LEDGF, с одной стороны, и взаимодействий комплекса этих двух белков с ДНК, с другой. До настоящего времени не известна полная структура интегразы ВИЧ-1, а также ее комплексов с ДНК и LEDGF/р75, поскольку не удается закристаллизовать полноразмерный каталитически активный белок и сделать его рентгеноструктурный анализ или ЯМР. Целью проекта является изучение связывания интегразы и комплекса интегразы с LEDGF с вирусной и клеточной ДНК, выяснение структурных характеристик вирусной ДНК, отвечающих за специфичность ее взаимодействия с интегразой, и роли LEDGF в этом взаимодействии. Для этого в рамках настоящего проекта планируется определение участков интегразы в комплексе с LEDGF/p75, взаимодействующих с ДНК, с помощью синтетических ДНК-дуплексов, содержащих реакционно-способные альдегидные и иодацетамидные группы и имитирующих субстрат интегразы и клеточную ДНК. Кроме того, для выяснения влияния структуры интегразы на ее активность будут получены мутантные формы интегразы, содержащие различные аминокислотные замены. Эта работа будет проводиться на Химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова. Параллельно в лаборатории биотехнологии и прикладной генетической фармакологии НЦНИ (Франция) с использованием модифицированных аналогов субстрата будет проведено изучение связывания интегразы и комплекса интеграза/LEDGF с ДНК методом поляризации флуоресценции, а также будет исследовано влияние мутаций, важных для взаимодействия интегразы с ДНК, на репликацию и инфекционность ВИЧ-1.
Целью проекта является изучение связывания интегразы и комплекса интегразы с LEDGF с вирусной и клеточной ДНК и выяснение структурных характеристик вирусной ДНК, отвечающих за специфичность ее взаимодействия с интегразой. Для этого были получены рекомбинантные белки: интеграза (ИН) ВИЧ-1, LEDGF/p75 и комплекс этих белков. Причем методика получения комплекса ИН с LEDGF/p75 была модифицирована. Для того чтобы осуществлять выделение без добавления детергентов, была использована His6-ИН, а также получена конструкция, кодирующая GST-LEDGF. Условия экспрессии GST-LEDGF были оптимизированы, а также отработана методика формирования и выделения комплекса His6-ИН/LEDGF. Кроме того, получены модифицированные субстраты ИН для проведения кросс-линкинга. Для этого были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие альдегидные и йодацетамидные группировки в 2’-положении углеводофосфатного остова в различных положениях ДНК-дуплекса, представляющего собой концевой фрагмент вирусной кДНК. Подобраны условия получения конъюгатов ИН с субстратами, содержащими альдегидные группы, а также отработана методика исчерпывающего гидролиза белковой части конъюгатов трипсином. Методом масс-спектрометрического анализа было показано, что с нуклеозидом в 6-м положении ДНК-субстрата в составе его комплекса с интегразой в присутствии LEDGF сближен остаток лизина 264. Мы подтвердили наличие этого контакта, используя введение замены K264C и кросс-линкинг субстрата, содержащего иодацетамидную группу, по остаткам цистеина. Кроме того, была подробно изучена роль С-концевого домена ИН ВИЧ-1 в связывании ДНК. Для этого был проведен сравнительный анализ модели комплекса ИН, ее клеточного кофактора LEDGF и вирусной ДНК со структурой комплекса другого ретровируса - пенообразующего вируса человека (ПВЧ), определенной методом РСА. При сравнении этих двух структур был выбран ряд аминокислотных остатков в С-концевом домене ИН, которые могут участвовать в связывании ДНК. Методом сайт-направленного мутагенеза были введены замены в петлевой участок С-концевого домена (D229A, R228A, R228C, R231A, D232A, K236A). Показано, что замены аргинина 228, а также лизина 236 приводят практически к полной потере каталитической активности ИН, а замены D229A и D232A вдвое снижают ее каталитическую активность. Далее было показано, что мутации D229A, D232A, R228A и K236А не влияют на сродство ИН к ДНК. В тоже время, методом поляризации флюоресценции обнаружено, что для этих белков ниже оказалось изменение анизотропии при связывании с ДНК, что может указывать на другое мультимерное состояние комплексов мутантов с субстратом. Была изучена кинетика 3’-процессинга и показано, что начальная скорость реакции для мутантных ИН существенно ниже, чем для ИН дикого типа. Кроме того, для оценки влияния введенных мутаций на взаимодействие ИН с субстратом был разработан новый метод. Он основан на изменении интенсивности флуоресценции остатка флуоресцеина, присоединенного на 3'-конец процессируемой цепи субстрата ИН, в процессе его связывания с белком и последующего процессинга. Метод позволяет отдельно изучать процессы связывания ИН с субстратом и протекания каталитической реакции 3’-процессинга. С использованием предложенного метода было изучено влияние мутаций R228A, D229A, R231A, D232A, K236A и K264A на связывание и процессинг флуоресцеин-меченного субстрата. Показано, что аминокислоты R228, D229, R231 и K264 вовлечены в процесс связывания ИН с субстратом, причем для аминокислот D229 и R231 эти данные получены впервые.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2009 г.-31 декабря 2009 г. | Использование модифицированных олигонуклеотидов для изучения структуры и функций интегразы ВИЧ-1 |
Результаты этапа: Для изучения связывания интегразы (ИН) ВИЧ-1 и комплекса ИН с LEDGF/p75 с вирусной и клеточной ДНК были получены рекомбинантные белки, причем методика получения комплекса ИН с LEDGF/p75 была модифицирована. Предложенная ранее методика была основана на выделении GST-ИН и His6-LEDGF в присутствии детергентов с последующим формированием их комплекса и его очисткой на глутатион-сефарозе. Для того чтобы осуществлять выделение без добавления детергентов, была использована His6-ИН, а также получена конструкция, кодирующая GST-LEDGF. Далее были оптимизированы условия экспрессии GST-LEDGF, а также отработана методика формирования и выделения комплекса His6-ИН/LEDGF. Кроме того, получены модифицированные субстраты ИН для проведения кросс-линкинга. Для этого были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие альдегидные и йодацетамидные группировки в 2’-положении углеводофосфатного остова в различных положениях ДНК-дуплекса, представляющего собой концевой фрагмент вирусной кДНК. Подобраны условия получения конъюгатов ДНК-субстратов, содержащих альдегидную группу, с комплексом ИН/LEDGF, а также отработана методика исчерпывающего гидролиза белковой части конъюгатов трипсином. Для выяснения локализации ДНК-субстрата в структуре комплекса ИН/LEDGF использовали метод масс-спектрометрического анализа. Было показано, что с нуклеозидом в 6-м положении ДНК-субстрата в составе его комплекса с интегразой в присутствии LEDGF сближен остаток лизина 264. | ||
2 | 1 января 2010 г.-31 декабря 2010 г. | Использование модифицированных олигонуклеотидов для изучения структуры и функций интегразы ВИЧ-1 |
Результаты этапа: Было продолжено изучение структуры и функций интегразы (ИН) ВИЧ-1. Для этого методом сайт-направленного мутагенеза мы получили мутантные формы ИН, содержащие замены в петлевом участке С-концевого домена (D229A, R228A, R228C, R231A, D232A, K236A), и показали, что замена аргинина 228 на аланин или цистеин, а также лизина 236 на аланин приводит практически к полной потере каталитической активности ИН, а замены D229A и D232A вдвое снижают ее каталитическую активность. Далее было показано, что мутации D229A, D232A, R228A и K236А не влияют на сродство ИН к ДНК. В тоже время, методом поляризации флюоресценции обнаружено, что для белков, содержащих замены D229A, D232A, R228A и K236А, ниже оказалось изменение анизотропии при связывании с ДНК, что может указывать на другое мультимерное состояние комплексов мутантов с субстратом. Была изучена кинетика 3’-процессинга и показано, что начальная скорость реакции для мутантных ИН существенно ниже, чем для ИН дикого типа. Таким образом, на основании полученных данных, можно сказать, что введение мутаций D229A, D232A, R228A и K236А влияет в первую очередь на скорость каталитической реакции, что может быть обусловлено "неправильной" структурой (мультимерным состоянием) фермент-субстратного комплекса. Кроме того, было продолжено изучение взаимодействия ИН с ДНК методом кросс-линкинга. Ранее этим методом с использованием субстратов, содержащих альдегидную группу, и последующим масс-спектрометрическим анализом было показано, что Lys264 ИН взаимодействует с 6-положением непроцессируемой цепи субстрата. Для подтверждения этого результата был использован кросс-линкинг по остаткам цистеина. Для этого в состав ИН, содержащей одновременно три замены C56S, C65S, C280S, были введены мутации K264C и R228C. Показано, что мутант ИН, содержащий только тройную замену C56S, C65S, C280S, не образует ковалентный комплекс с ДНК-субстратом, содержащим активную группу в 6-м положении непроцессируемой цепи. Мутант C56S, C65S, C280S, K264C образовывал ковалентный комплекс с выходом около 10 %. Таким образом, мы подтвердили наличие контакта К264 с 6-м положением непроцессируемой цепи субстрата. В случае мутанта C56S, C65S, C280S, R228С эффективность кросс-линкинга составила около 3%. Это может указывать на сближенность R228 с 6-м положением непроцессируемой цепи субстрата, однако для окончательного вывода необходимы дополнительные эксперименты. | ||
3 | 1 января 2011 г.-31 декабря 2011 г. | Использование модифицированных олигонуклеотидов для изучения структуры и функций интегразы ВИЧ-1 |
Результаты этапа: Целью проекта является изучение связывания интегразы и комплекса интегразы с LEDGF с вирусной и клеточной ДНК и выяснение структурных характеристик вирусной ДНК, отвечающих за специфичность ее взаимодействия с интегразой. Для этого были получены рекомбинантные белки: интеграза (ИН) ВИЧ-1, LEDGF/p75 и комплекс этих белков. Причем методика получения комплекса ИН с LEDGF/p75 была модифицирована. Для того чтобы осуществлять выделение без добавления детергентов, была использована His6-ИН, а также получена конструкция, кодирующая GST-LEDGF. Условия экспрессии GST-LEDGF были оптимизированы, а также отработана методика формирования и выделения комплекса His6-ИН/LEDGF. Кроме того, получены модифицированные субстраты ИН для проведения кросс-линкинга. Для этого были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие альдегидные и йодацетамидные группировки в 2’-положении углеводофосфатного остова в различных положениях ДНК-дуплекса, представляющего собой концевой фрагмент вирусной кДНК. Подобраны условия получения конъюгатов ИН с субстратами, содержащими альдегидные группы, а также отработана методика исчерпывающего гидролиза белковой части конъюгатов трипсином. Методом масс-спектрометрического анализа было показано, что с нуклеозидом в 6-м положении ДНК-субстрата в составе его комплекса с интегразой в присутствии LEDGF сближен остаток лизина 264. Мы подтвердили наличие этого контакта, используя введение замены K264C и кросс-линкинг субстрата, содержащего иодацетамидную группу, по остаткам цистеина. Кроме того, была подробно изучена роль С-концевого домена ИН ВИЧ-1 в связывании ДНК. Для этого был проведен сравнительный анализ модели комплекса ИН, ее клеточного кофактора LEDGF и вирусной ДНК со структурой комплекса другого ретровируса - пенообразующего вируса человека (ПВЧ), определенной методом РСА. При сравнении этих двух структур был выбран ряд аминокислотных остатков в С-концевом домене ИН, которые могут участвовать в связывании ДНК. Методом сайт-направленного мутагенеза были введены замены в петлевой участок С-концевого домена (D229A, R228A, R228C, R231A, D232A, K236A). Показано, что замены аргинина 228, а также лизина 236 приводят практически к полной потере каталитической активности ИН, а замены D229A и D232A вдвое снижают ее каталитическую активность. Далее было показано, что мутации D229A, D232A, R228A и K236А не влияют на сродство ИН к ДНК. В тоже время, методом поляризации флюоресценции обнаружено, что для этих белков ниже оказалось изменение анизотропии при связывании с ДНК, что может указывать на другое мультимерное состояние комплексов мутантов с субстратом. Была изучена кинетика 3’-процессинга и показано, что начальная скорость реакции для мутантных ИН существенно ниже, чем для ИН дикого типа. Кроме того, для оценки влияния введенных мутаций на взаимодействие ИН с субстратом был разработан новый метод. Он основан на изменении интенсивности флуоресценции остатка флуоресцеина, присоединенного на 3'-конец процессируемой цепи субстрата ИН, в процессе его связывания с белком и последующего процессинга. Метод позволяет отдельно изучать процессы связывания ИН с субстратом и протекания каталитической реакции 3’-процессинга. С использованием предложенного метода было изучено влияние мутаций R228A, D229A, R231A, D232A, K236A и K264A на связывание и процессинг флуоресцеин-меченного субстрата. Показано, что аминокислоты R228, D229, R231 и K264 вовлечены в процесс связывания ИН с субстратом, причем для аминокислот D229 и R231 эти данные получены впервые. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".