ИСТИНА

Проект посвящен изучению ферментативных систем митохондрий, участвующих в образовании супероксид-радикала и перекиси водорода. Мы планируем исследовать генерацию активных форм кислорода различными формами дигидролипоамиддегидрогеназы (свободной, связанной с мембраной и связанной с дегидрогеназами альфа-кетокислот), а также сравнить скорости генерации перекиси водорода интактными митохондриями в присутствии "классических" субстратов (пируват, сукцинат) и аммоний-продуцирующих субстратов (глутамат, глутамин, глицин).

Обнаружено, что препарат инвертированных внутренних мембран митохондрий сердца быка (субмитохондриальные частицы, СМЧ) содержит в своем составе прочносвязанную дигидролипоамиддегидрогеназу (ДЛД), катализирующую как липоамидредуктазную активность (восстановление окисленного липоамида NADH), так и недавно обнаруженную в нашей лаборатории аммоний-стимулируемую NADH-зависимую генерацию перекиси водорода. Очищенный гомогенный растворимый фермент сердца быка, коммерческий препарат растворимой ДЛД сердца свиньи, ДЛД в составе митоходриальной мембраны (СМЧ), а также белковая фракция митохондрий сердца крысы, содержащая ДЛД в составе комплексов дегидрогеназ альфа-кетокислот, катализируют NADH-зависимую генерацию перекиси со сходными кинетическими параметрами. Показано, что примерно половина от общей NADH-зависимой продукции перекиси водорода пермеабилизованными митохондриями в отсутствие стимулирующего аммония образуется при участии ДЛД, а вторая половина АФК приходится на долю мембраносвязанного комплекса I. Исследована зависимость скорости NADH-зависимой генерации АФК мембранно-связанным комплексом I сердца быка, растворимой ДЛД сердца свиньи, а также пермеабилизованным препаратом митохондрий сердца крысы от общего содержания пиридиннуклеотидов и их редокс-состояния. Показано, что комплекс I в составе СМЧ способен к генерации как супероксида, так и перекиси водорода. Скорость продукции супероксида достигает полумаксимального значения при значительно более высоком отношении NAD+/NADH (0,33), чем скорость образования перекиси водорода (0,13). Полученные данные позволили предположить участие, по меньшей мере, двух центров в опосредуемой комплексом I генерации АФК: флавинмононуклеотида, при участии которого образуется перекись водорода, и железо-серного центра (вероятно N-2), который отвечает за продукцию супероксид-аниона. Разработан метод выделения рекомбинантной ДЛД человека из культуры клеток E. coli XL1-Blu, содержащей плазмиду с ДЛД человека.