ИСТИНА

Воспроизведение генетического материала в неизменном виде при делении клеток является важнейшим условием поддержания здорового состояния организмов. Неточная работа ДНК-полимераз в процессе репликации и воздействие мутагенных факторов среды приводит к появлению в ДНК некомплементарных пар нуклеозидов («мисматчей»). Данный проект сфокусирован на изучении системы репарации «мисматчей» (MMR, от англ. mismatch repair). Система MMR обнаружена во всех царствах живых организмов и характеризуется высокой консервативностью первичной структуры её ключевых белков MutS и MutL от бактерий до высших эукариот. Предполагается, что основные механизмы репарации «мисматчей» сходны для всех организмов. Открытие связи между онкологическими заболеваниями человека и MMR обуславливает необходимость исследования деталей функционирования этой системы. Репарация «мисматчей» инициируется после узнавания неканонической пары белком MutS и формирования комплекса MutS-MutL. Считается, что MutL играет центральную роль в координации различных этапов MMR. Главной задачей проекта является сравнительное изучение функций белка MutL из клеток E. coli и Bacillus subtilis и человека и выяснение молекулярных механизмов его взаимодействия с белками–партнерами и ДНК в системе репарации MMR. В ходе проекта будут сконструированы уникальные ДНК-реагенты, которые позволят зафиксировать непрочные и динамически подвижные белково-нуклеиновые комплексы. Планируется определить локализацию MutL и комплекса MutS-MutL на ДНК и выявить группы атомов в ДНК, вовлеченные во взаимодействие с этими белками. Будут изучены конформационные изменения в MutL в ответ на связывание АТФ, ДНК и присутствие других белков – участников процесса репарации, установлена взаимосвязь между АТФазной и ДНК-связывающими активностями MutL. Предполагается детально изучить эндонуклеазную функцию MutL из клеток Bacillus subtilis и человека. Планируется выяснить влияние факторов процессивности ДНК-полимераз, хеликазы и гистонов на функционирование системы MMR. Будут охарактеризованы мутантные формы гомологов MutL, ассоциированные с синдромом Линча. Реализация проекта позволит прояснить многие вопросы в функционировании системы репарации MMR, которые на сегодняшний день являются спорными, и разработать подходы к регулированию активности белка MutL, что очень важно для понимания причин возникновения ряда онкологических заболеваний.

Центральным объектом исследования являлся белок MutL, играющий ключевую роль в координации различных этапов репарации неканонических пар нуклеотидов (MMR). Метод аффинной модификации белка реакционноспособными ДНК, основанный на реакции тиол-дисульфидного обмена, применен для зондирования аминокислотных остатков MutL из E. coli, контактирующих с 59-звенным дуплексом с G/T-«мисматчем». Пиридилдисульфидная группа была введена в С5-положение остатка Т на линкерах различной длины. Оценена эффективность образования коньюгатов между ДНК и моноцистеиновыми мутантными формами MutL(Q118С), MutL(T218С), MutL(A251С), MutL(A282С) и MutL(H297С). Аминокислотные остатки в позициях 218, 251 и 282 наиболее сближены с ДНК. 59-Звенные дуплексы с пиридилдисульфидной группировкой в одной цепи и флуорофорами Atto-488 и Alexa-594, расположенными в другой цепи с двух сторон от G/T-пары, использовали для фиксации на ДНК мутантной формы белка MutS, ответственного за идентификацию «мисматчей». Разработана методика выделения из реакционной смеси конъюгата MutS(N497C)-ДНК с помощью анионообменной ВЭЖХ. Методом флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) показано, что белок MutS в составе конъюгата способен «разгибать» ДНК при добавлении АТФ. Методом «остановленного потока» установлено, что скорость конформационной перестройки ДНК повышается с увеличением концентрации АТФ. Таким образом, белок MutS в составе ДНК-белкового конъюгата сохраняет свою активность. Предложена оригинальная методика слежения за конформационными переходами MutS, основанная на регистрации FRET, возникающего между красителем Sytox Blue, неспецифично связывающимся с ДНК (донор флуоресценции), и акцептором Alexa-594, ковалентно присоединенным к MutS. Впервые предложен комплексный биохимический подход для характеристики взаимодействия любого повреждения ДНК с системой MMR в целом и белком MutS в частности. Этот подход продемонстрирован на примере ДНК, содержащих остаток тимидингликоля. Клонированы гены белков MutL и MutS из Rhodobacter sphaeroides. Показано, что белок MutL из этой бактерии обладает эндонуклеазной функцией. Полноразмерные белки MutL из E. coli и Rhodobacter sphaeroides являются многодоменными и конформационно подвижными. Для изучения их структуры наиболее приемлемым представляется метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей. Для отработки экспериментального подхода этим методом была изучена структура двухдоменной ДНК-метилтрансферазы SsoII.