Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеванийНИР

Epigenetic mechanisms of biological processes and their role in pathogenesis of oncological disease

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 13 апреля 2023 г.-31 декабря 2023 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа: Изучено влияние вариантов и эпигенетических модификаций гистонов Н3.3, H2A.Z и H3K56Q на структуру нуклеосом. Установлено, что вариантные гистоны изменяют укладку нуклеосомной ДНК на октамере гисто- нов и ее динамику, модулируя стабильность нуклеосом и влияя, вероятно, тем самым на доступность нуклеосомной ДНК для ядерных факторов и на эффективность процессов транскрипции, репликации и репарации ДНК. На примере гистона Н3.3 показано, что вариантные гистоны влияют на способность фермента PARP1 модулировать структуру нуклеосом. Методом spFRET-микроскопии установлено, что линкерный гистон Н1.0, связываясь с нуклеосомой, не только сближает между собой линкерные участки ДНК, но и вносит изменения в структуру нуклеосомной ДНК. Эти структурные изменения происходят по всей длине нуклеосомной ДНК и сопровождаются увеличением расстояния между соседними супервитками ДНК. Установлено, что способность дрожжевого белкового комплекса FACT в присутствии белка Nhp6 к АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом является универсальной и не зависит от вида гистонов, на которых сформированы нуклеосомы. Нуклеосомы, собранные на октамерах гистонов Homo sapiens, реорганизуются дрожжевым FACT в присутствии Nhp6 с образованием асимметричной, почти линейной структуры, такой же, как и в случае нуклеосом, собранных на октамерах гистонов Xenopus laevis. Были наработаны и очищены препараты белков HMO1, HMGB1 и полноразмерного yFACT, а также его мутантных форм, содержащих делеции одного или обоих С-концевых фрагментом субъединиц Spt16 и Pob3. Показано, что взаимодействие HMO1 с FACT, которое способствует АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом, происходит по С-концам субъединиц Spt16 и Pob3, как и в случае гомологичного белка Nhp6. Апробирована методика дизайна пептидов, связывающихся с кислотным лоскутом нуклеосомы, на основе нейросетевого алгоритма ProteinMPNN. Для сгенерированных нейросетью полипептидных последовательностей с помощью нейросетевого алгоритма AlphaFold предсказаны структуры комплексов этих полипептидов с нукле- осомой. Эти структуры позволят провести in silico скрининг предложенных искусственным интеллектом пептидных последовательностей и отобрать наиболее перспективные пептиды для дальнейших исследований. Для измерения констант связывания флуоресцентно-меченых пептидов с нуклеосомами разработан протокол высокоточных измерений на основе анализа поляризации флуоресценции в малых объемах в планшетном формате. Разработаны программы для анализа данных, полученных в ходе измерений, и для определения константы диссоциации изучаемых комплексов. С использованием разработанного протокола определена константа диссоци- ации комплекса пептида LANA(1-22) с нуклеосомой. Для анализа взаимодействия белков р53 и PARP-1 с нуклеосомами получены флуоресцентно-меченые нуклеосомы,отличающиеся ротационной ориентацией сайта свя- зывания белка p53, расположенного на расстоянии 11 или 16 п.н. от границы нуклеосомы. Методом spFRET-микроскопии охарактеризована конформация линкерной ДНК и ее отличия для этих двух типов нуклеосом. Установлены изменения конформации нуклеосом при различной ротационной ориентации сайта связывания белка p53, и показано, что фермент PARP1 формирует различные комплексы с этими нуклеосомами. Для исследования влияния антираковых препаратов кураксинов на формирование Z-ДНК была создана плазмида, содержащей классическую Z-ДНК-образующую последовательность и разработана экспериментальная система для детекции Z-ДНК в негативно сверхспирализованной плазмидной ДНК. С использованием этой экспериментальной системы было определено, что на сверхспиральной плазмиде pYPCG32 Z-ДНК образуется в ожидаемом положении. Были получены высокочистые активные препараты РНК полимеразы II и фактора транскрипции TFIIS дрожжей. С помощью полимеразной цепной реакции получена матрица для сборки нуклеосом, позволяющая детектировать их положение после транскрипции с помощью рестриктного анализа. Разработан новый, оптимальный протокол флуоресцентного пульс-мечения РНК для анализа РНК-продуктов различной длины, образующихся при транскрипции in vitro. Получены нуклеосомы с однонитевыми разрывами нематричной цепи в положениях +12 и +22 нт от начала нуклеосомы и на них продемонстрирована применимость разработанного метода мечения РНК для изучения остановок РНК полимеразы, индуцируемых разрывом. В ходе экспериментов по транскрипции in vitro определено положение наиболее эффективной ник-индуцированной остановки РНКП при прохождении нуклеосом с разрывом нематричной цепи ДНК после 2 нт от входа в нуклеосому. Методом ПЦР-мутагенеза сконструирована матричная ДНК, позволяющая в ходе транскрипции в условиях ограниченного набора рНТФ получить элонгационный комплекс с РНКП, остановленной в этом положении независимо от наличия разрыва ДНК. Для изучения локальных изгибов центромерной ДНК пекарских дрожжей методом spFRET-микроскопии сконструированы и получены короткие флуоресцентно-меченые дуплексы ДНК с нуклеотидной последовательностью, которая, как предполагается, не вызывает образования изгиба (ранее были получены аналогичные дуплексы с последователь ностью участка центромерной ДНК). Исследования методом spFRET микроскопии показали отсутствие изгиба ДНК в сконструированных «прямых» дуплексах и тем самым дополнительно подтвердили наличие локального из- гиба в участке центромерной ДНК пекарских дрожжей, выявленного ранее методом spFRET микроскопии.
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".