ИСТИНА

Проект направлен на изучение молекулярных механизмов образования амилоидных фибрилл - чрезвычайно прочных нерастворимых линейных белковых агрегатов, которые являются причиной многих неизлечимых заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, диабет и другие. Понимание механизмов образования амилоидов является важным этапом на пути создания эффективных терапевтических препаратов. Для этого необходимо располагать достаточно простыми и удобными модельными системами. В качестве таковых могут служить экспрессируемые в бактериальных клетках амилоидогенные белки.

В рамках проекта за отчетный период с использованием методов генетической инженерии, сайт-специфического мутагенеза, гетерологичной экспрессии в бактериальных клетках и аффинной хроматографии получена серия мутантных вариантов ряда белков: сигма70-субъединицы РНК-полимеразы E.coli, транскетолазы человека (hTKТ), РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса менго, белка Е1 вируса гепатита С. В различных системах in vitro изучена функциональная активность выделенных белковых препаратов, а также получены первые данные о способности некоторых из указанных белков к агрегации. Наибольшее внимание уделено исследованию свойств мутантных вариантов сигма70-субъединицы, содержащих делеции в N-концевой области. В экспериментах по комплексообразованию с промоторной ДНК и транскрипции in vitro исследована функциональная активность мутантов в составе холофермента РНК-полимеразы; подтверждена модулирующая роль N-концевого домена на стадии инициации транскрипции. С использованием физико-химических методов исследования (атомно-силовая микроскопия, окрашивание специфическими красителями, гель-электрофорез) изучено влияние структуры N-концевого домена на агрегационные свойства сигма70-субъединицы. Изучена зависимость эффективности образования амилоидов от температуры, ионной силы, концентрации белка, присутствия низкомолекулярных лигандов. На основании полученных данных предложена оригинальная модель формирования амилоидных фибрилл, которая предполагает ступенчатую ассоциацию белковых мономеров по типу "обмена доменами" с участием N-концевого домена. За отчетный период с использованием методов молекулярного клонирования, сайт-специфического мутагенеза и аффинного выделения были получены новые интересные объекты исследования: белок ядерного экспорта NS2 вируса гриппа А c делециями на N-конце, а также составной белок NS2-GFP; новые мутантные варианты сигма70-субъединицы РНК-полимеразы E.coli с точечными заменами аминокислотных остатков , а также варианты структурных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С с «выключенными» сайтами гликозилирования. Кроме того, создана бакуловирусная система, позволяющая одновременно экспрессировать белки Е1 и Е2, в клетках насекомых и изучать агрегацию как индивидуальных белков, так и димера Е1Е2, in vivo. С использованием различных физико-химических методов исследования: атомно-силовая микроскопия (АСМ), светорассеяние, флуоресцентная спектроскопия, окрашивание специфическими красителями, гель-электрофорез, - продемонстрирована способность всех указанных белков формировать при определенных условиях амилоидоподобные агрегаты. Впервые в рамках проекта была отработана методика визуализации с помощью АСМ белковых наночастиц непосредственно в водных растворах без предварительного высушивания образцов. В результате впервые для сигма-субъединицы и ее некоторых мутантных вариантов было обнаружено существование не только палочкообразных амилоидов, но и других линейных агрегатов, имеющих вид «бусин на нити». Кроме того, впервые было показано, что белок NS2, а также его мутантные варианты способны формировать крупные сферические агрегаты и палочкообразные частицы амилоидного типа. На основании результатов проведенных экспериментов, а также анализа данных литературы, предложена универсальная модель формирования амилоидных фибрилл, которая предполагает линейную ассоциацию мономеров в изогнутые олигомеры, которые по достижении «критического» размера могут замыкаться в псевдоцикл, служащий жесткой матрицей для дальнейшего роста фибрилл. Возможность реализации такого механизма была подтверждена методом молекулярного моделирования самосборки сигма-субъединицы.