Разность электрохимических потенциалов ионов водорода как фактор, регулирующий активность ферментов энергетического обмена в сопрягающих мембранах эукариот и прокариотНИР

The difference in the electrochemical potentials of hydrogen ions as a factor regulating the activity of the energy-transducing enzymes in coupled membranes of eukaryotes and prokaryotes

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Изучение кинетики pmf-зависимого гидролиза АТР и оценка вклада стационарных концентраций ADP и величины pmf на соотношение двух равновесных форм Fo∙F1-АТРазы. Изучение кинетики pmf-зависимого обратного переноса электронов от убихинола на гексаамминорутений (HAR), катализируемого комплексом I, и влияния pmf на сродство NADH- и убихинон-связывающего центров комплекса I к специфическим ингибиторам фермента.
Результаты этапа: Мы подробно охарактеризовали реакцию АТР-зависимого восстановления NAD+ сукцинатом в мембранах Paracoccus denitrificans. В результате мы получили возможность исследовать влияние pmf на гидролитическую активность Fo∙F1-АТРазы. Мы показали, что параметры гидролиза АТР, измеренные по восстановлению NAD+ в обратном переносе, в основном совпадают с таковыми, определенными ранее по ответу индикатора фенолового красного. Однако мы получили указание на то, что pmf влияет на параметры взаимодействия фермента с субстратом реакции (АТР): pmf значительно увеличивала сродство фермента к АТР. Разработанные условия измерения позволили нам детально исследовать торможение вентурицидином Fo∙F1-АТРазы/синтазы в составе прочносопряженных мембран P. denitrificans в условиях генерации мембранного потенциала. Ранее мы показали, что вентурицидин, специфический Fo-направленный ингибитор, блокирует синтез и гидролиз АТР со значительным различием в сродстве (Zharova, T.V., and Vinogradov, A.D. (2017) Biochim. Biophys. Acta, 1858, 939–944). Однако это изменение в сродстве ингибитора можно было интерпретировать как результат влияния pmf, кардинально различающейся в условиях синтеза и гидролиза АТР. Гидролиз АТР, регистрируемый по АТР-зависимому обратному переносу электронов на NAD+, позволил выровнять условия измерения синтеза и гидролиза АТР в отношении pmf. В таких условиях мы обнаружили сигмоидальную зависимость остаточной АТР-гидролазной активности и линейную зависимость остаточной АТР-синтазной активности от концентрации вентурицидина. Таким образом, в области низких концентраций ингибитора значительное торможение синтеза АТР вентурицидином не сопровождается падением скорости гидролиза. Полученные результаты мы рассматриваем как подтверждающие разрабатываемую в нашей лаборатории гипотезу, согласно которой синтез и гидролиз АТР катализируют две разные формы Fo∙F1 (Виноградов А.Д. (2019) Биохимия, 84, 1553–1563). Мы показали значительное различие в действии ингибиторов убихинон-связывающего центра комплекса I (ротенона, капсаицина и дигидрокапсаицина) в препаратах СМЧ и в плазматических мембранах P. denitrificans в прямой реакции разобщенного окисления NADH и при энергизации мембран в условиях АТР-зависимого обратного переноса электронов на NAD+. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при энергизации мембраны в условиях обратного переноса электронов связывание этих ингибиторов комплекса I становится менее прочным. Мы подробно исследовали NADH:HAR-редуктазную активность комплекса I в СБЧ и показали отклонение этой реакции от простой кинетики Михаэлиса, которое указывает на то, что в зависимости от концентрации акцептор HAR может взаимодействовать с более, чем одним центром фермента, причем редокс потенциал центра, взаимодействующего с низкими концентрациями акцептора, значительно выше редокс потенциала FMN и основной группы железо-серных центров фермента. Мы впервые подобрали экспериментальные условия и обнаружили, что комплекс I в составе СБЧ P. denitrificans катализирует обратный перенос электронов на HAR, чувствительный к действию разобщителей и ингибиторов убихинон-связывающего центра фермента и нечувствительный к NADH-OH. Таким образом, этот процесс происходит без участия FMN. Полученные результаты демонстрируют универсальность открытого нами FMN-независимого обратного переноса электронов на HAR для всех типов протонтранслоцирующих NADH:убихинон-оксидоредуктаз.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Определение стехиометрического соотношения между векторно перенесёнными протонами и гидролизованными (синтезированными) АТР в мембранах P. denitrificans (коэффициент →Н+/АТР). Определение кинетических и термодинамических параметров реакции перехода между активной и деактивированной формами комплекса I и исследование влияния энергизации мембраны на этот переход. Изучение способности деактивированной формы комплекса I переходить в активную форму фермента в реакции pmf-зависимого обратного переноса электронов от убихинола на NAD+ и гексаамминорутений (HAR).
Результаты этапа: Разработан методический прием, позволяющий освободить препарат суббактериальных частиц P. denitrificans (СБЧ) от ADP. Процедура включает инкубацию препарата СБЧ P. denitrificans в присутствии щелочной фосфатазы (ЩФ) или апиразы. Мы показали, что такая обработка приводила к активации окисления NADH и падению мембранного потенциала. Субстраты/продукты F1·Fo синтазы/АТРазы – ADP (или IDP), неорганический фосфат (Pi) (или арсенат), а также ингибиторы фермента AMP-PNP (негидролизуемый аналог АТР) и вентурицидин (ингибитор Fo-канала) предотвращали и обращали вызванное ЩФ разобщение. Однако освобождение F1·Fo P. denitrificans ADP не приводило к активации латентной АТРазной активности. Мы заключили, что для понимания однонаправленного катализа F1∙Fo возможно требуются более сложные схемы, включающие участие нескольких регуляторных механизмов и взаимодействие между механизмами регуляции с помощью белков-ингибиторов и ADP(Mg2+)-торможением [1]. Для F1·Fo P. denitrificans мы определили стехиометрический коэфициент H+/ATP (отношение числа векторно перенесенных протонов к количеству гидролизованных/синтезированных молекул АТР), величина которого в разных условиях варьировала от 3 до 4,5, что близко к ожидаемому теоретическому H+/ATP, равному 4. Мы определяли H+/ATP путем измерения начальных скоростей гидролиза АТР, катализируемого F1·Fo, и начальных скоростей сопряженного с этим процессом восстановления NAD+ комплексом I в реакции АТР-зависимого обратного переноса электронов, охарактеризованного при выполнении первого этапа проекта. Мы показали, что pmf не влиял на величину H+/ATP. Высокие значения H+/ATP были получены в присутствии 100 мкМ Pi в среде измерения. Обнаруженное влияние субстратов на сопряжение между F1 и Fo, а также влияние Pi на гидролитическую активность F1·Fo в энергизованных мембранах и на величину H+/ATP мы рассматриваем в рамках гипотезы о существовании в сопрягающих мембранах двух форм фермента, характеризующихся разной эффективностью окислительного фосфорилирования и АТР-зависимой генерации потенциала [2]. Мы выяснили, как влияют на изменение сродства комплекса I к ингибиторам нуклеотид- и убихинон-связывающих центров фермента потенциал на мембране и/или восстановление его редокс-центров. С этой целью мы определили параметры связывания NADH-OH (специфический ингибитор нуклеотид-связывающего центра) в различных условиях и показали, что в отсутствие потенциала на мембране независимо от того, окислены редокс-компоненты комплекса I или восстановлены, константа скорости второго порядка k при взаимодействии NADH-OH с ферментом составляет 1,7•108 М-1мин-1. Энергизация мембраны за счет реакции гидролиза АТР в отсутствие сукцината, который в реакции обратного переноса обычно используют в качестве восстановителя убихинона, снижает эту константу до 1,2•108 М-1мин-1. Мы определили константу скорости диссоциации ингибитора из комплекса фермента с NADH-OH, равную 0,06 мин-1. На величину этой константы энергизация мембраны гидролизом MgATP не влияет. Мы исследовали связывание ротенона с комплексом I в ходе NADH-оксидазной реакции в присутствии разобщителя, когда мембрана субмитохондриальных частиц (СМЧ) деэнергизована, и в его отсутствие, когда на мембране создается pmf. Оказалось, что энергизация мембраны СМЧ приводит к замедлению взаимодействия с ротеноном и снижению константы скорости второго порядка примерно в два раза по сравнению с экспериментом, проведенным в присутствии разобщителя (k=0,16•108 М-1мин-1 в энергизованных мембранах против k=0,38•108 М-1мин-1 в условиях разобщения). Так как при окислении NADH добавление разобщителей не меняет уровень восстановленности редокс-компонентов фермента [3], наблюдаемые различия связаны прежде всего с наличием или отсутствием протонного потенциала на мембране. Такой вывод подтверждается результатами измерения константы скорости связывания ротенона в опытах, когда СМЧ инкубировали с ротеноном в отсутствие NADH, когда все редокс-компоненты комплекса I были окислены, а реакцию начинали добавлением NADH и разобщителя. Как восстановленный фермент, так и полностью окисленный комплекс I с одинаковыми скоростями взаимодействуют с ротеноном. Другой ингибитора фермента, дигидрокапсаицин, быстро и равновесно связывается с комплексом I, поэтому в качестве характеристики его связывания с ферментом мы использовали равновесную константу ингибирования Ki (константа диссоциации комплекса фермента с ингибитором). В деэнергизованных СМЧ, катализирующих NADH-оксидазную реакцию в присутствии разобщителя, падение активности в присутствии дигидрокапсаицина происходит с Ki, равной 7 мкМ. В отсутствие разобщителя, когда при окислении NADH на мембране СМЧ создается протонный градиент, или в реакции потенциал-зависимого обратного переноса электронов на NAD+ Ki увеличивается до 25 мкМ. Полученные данные, как и в случае ротенона, свидетельствуют о том, что энергизация мембраны, но не восстановление редокс-компонентов фермента, меняет параметры связывания комплекса I с ингибиторами убихинон-связывающего центра фермента. Мы исследовали, как энергизация мембраны СМЧ может влиять на скорость перехода Д-формы фермента в А-форму в энергизованных и деэнергизованных СМЧ и показали, что энергизация мембраны ускоряет переход Д-формы фермента в активное состояние: наблюдаемая константа скорости активации k при энергизации мембраны увеличивалась с 0,8 мин-1 до 1,4 мин-1 по сравнению с Д/А-переходом в отсутствие pmf. Как уже было сказано, для того, чтобы Д-форма комплекса I перешла в активное состояние (А-форма) фермент должен совершить каталитический оборот: окислить NADH и восстановить убихинон. До сих пор возможность такой трансформации для Д-формы фермента в реакции обратного переноса электронов продемонстрирована не была. Поэтому мы изучили способность деактивированной формы комплекса I переходить в активную форму в реакции pmf-зависимого обратного переноса электронов от убихинола на NAD+ и показали, что в присутствии субстратов реакции Д-форма фермента не способна переходить в А-форму и катализировать реакцию. Ранее в нашей лаборатории было показано, что переход из Д-формы в активную может происходить не только в результате каталитического оборота в прямой реакции окисления NADH, но и при инкубации Д-формы с ротеноном, который с высоким сродством взаимодействует с убихинон-связывающим центром. Мы проверили, вызывает ли Д/А переход инкубация фермента с другим ингибитором этого центра, дигидрокапсаицином, и обнаружили, что активации Д-формы комплекса I дигидрокапсаицином не происходит. Мы предположили, что ротенон вызывает активацию Д-формы фермента, взаимодействуя не с убихинон-связывающим центром, а в альтернативном сайте, недавно обнаруженном в структуре фермента и расположенном в мембранном домене в непосредственной близости к аминокислотным остаткам, принимающим участие в векторном переносе протонов [4]. По всей видимости дигидрокапсаицин не способен связываться в этом участке, поэтому он не вызывает активацию Д-формы фермента. В результате проделанной работы мы можем заключить, что энергизация мембраны приводит к конформационным изменениям в структуре комплекса I, а также влияет на скорость перехода между активной и деактивированной формами фермента таким образом, что стабилизирует комплекс I в активном состоянии. Другими словами, pmf на сопрягающих мембранах можно рассматривать как фактор, регулирующий активность комплекса I. Литература 1. Жарова Т.В., Кареева А.В. (2023) Тезисы 4 Российского микробиологического конгресса, Томск, сентябрь 2023, стр. 124. 2. Zharova T.V., Grivennikova V.G., Borisov V.B. (2023) Int. J. Mol. Sci., 24, 5417. 3. Burbaev D.Sh., Moroz I.A.,Kotlyar A.B., Sled V.D., Vinogradov A.D. (1989) FEBS Lett., 254, 47–51. 4. Kampjut D., Sazanov L.A. (2020) Science 370, eabc4209.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".