Энергетика аэробной клеткиНИР

Energetics of aerobic cell.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Энергетика аэробной клетки
Результаты этапа: За истекший период получены следующие результаты. а) Протон-транслоцирующая F1∙Fо АТРаза/синтетаза. Впервые прослежены синхронные изменения трансмембранного протонного потенциала и скорости потребления кислорода в ходе синтеза АТР инвертированными фрагментами плазматической мембраны P. denitrificans. Показано, что в контролируемом состоянии дыхания (состояние 4) фосфорильный потенциал (соотношение) АТР/ADPхPi не уравновешен протон-движущей силой. Предложен возможный механизм кинетического контроля синтеза АТР. Показано одностороннее влияние цитоплазматического рН на катализ ферментом синтеза и гидролиза АТР. б) Дыхательный комплекс I. Мы подтвердили, что комплекс I количественно «главный» компонент дыхательной цепи компонент дыхательной цепи, генерирующий АФК, и показали, что распределение между образованием двух форм АФК (перекись водорода и супероксид-радикал) зависит от концентрации субстрата-донора (NADH). При низких концентрациях NADH фермент образует супероксид, а при повышении концентрации NADH происходит перераспределение АФК с преимущественным образованием перекиси водорода. в) Дыхательный комплекс II.Проведены изучение генерации АФК дыхательным комплексом II (сукцина:убихинон редуктаза).
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Энергетика аэробной клетки
Результаты этапа: 1. На основании анализа кинетики генерации АФК комплексом II предложена гипотеза об индукции дикарбоксилатами значительных структурных изменений в области, прилегающей к железо-серному кластеру S3 комплекса II. 2. Анализ рН-зависимости и чувствительности к специфическому ингибитору вентурицидину позволил предположить существование в энерго-сопрягающих мембранах двух различных молекулярных изоформ Fo∙F1: одной, катализирующей синтез, а другой гидролиз АТР.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Энергетика аэробной клетки
Результаты этапа: Мы получили следующие результаты. Fo∙F1-ATP синтетаза. 1. На препаратах прочно сопряженных инвертированных плазматических мембран Paracoccus denitrificans получены характеристики действия вентурицидина, ингибитора эукариотического комплекса Fo∙F1. Показано, что эффективность ингибирующего действия вентурицидина значительно отличается в зависимости от направления реакции (гидролиз или синтез АТР), катализируемой Fo∙F1. 2. Получены основные кинетические характеристики АТР-зависимого обратного переноса электронов, катализируемого сопряженными мембранами P. denitrificans. Дыхательный комплекс I. 1. В прочносопряженных субмитохондриальных частицах изучено влияние энергизации мембран на параметры А/Д-перехода (скорости деактивации и активации хинон-редуктазной активности митохондриального комплекса I). Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения, о торможении деактивацию в результате энергизация мембраны. 2. На основе анализа взаимодействия митохондриального комплекса I с искусственным акцептором электронов гексааминорутением (III), было показано каталитически компетентное взаимодействие между гексааминорутением (III) и редокс-компонентом комплекса I, отличающемся от находящегося в субстрат-связывающем центе фермента флавинмононуклеотида.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Энергетика аэробной клетки
Результаты этапа: 1. Комплекс I дыхательной цепи 1.1. А/Д переход Тридцать лет тому назад нашей группой было описано превращение протон-транслоцирующей каталитической активности NADH:убихинон-редуктазного участка дыхательной цепи митохондрий из «нормального» активного (А) состояния в неактивное (Д) и обратно (А/Д переход, Complex I A/D transition). Это явление привлекло внимание главных исследовательских групп, работающих в области биоэнергетики в Европе, США и Великобритании. В настоящее время ни его механизм, ни возможное физиологическое значение остается неизвестным и ограничивается гипотетическими предположениями. Основные факты, касающиеся А/Д перехода суммированы ниже. 1. Любой препарат дыхательной цепи митохондрий представлен смесью активной (А) и деактивированной (Д) форм комплекса I. 2. А/Д переход не наблюдается у прокариот. 3. Скорость А→Д перехода аномально чувствительна к температуре. 4. Трансформация комплекса в деактивированное состояние инициируется условиями, в которых его каталитическая активность запрещена (анаэробиоз, отсутствие субстратов). 5. Деактивация сопровождается (или инициируется) появлением SH-группы, блокирование которой препятствует обратному процессу (Д→А переход). 6. При добавлении субстратов Д-форма быстро, но существенно медленнее, чем обороты фермента в его обычном каталитическом цикле, превращается в А-форму. В настоящей работе мы сообщаем новые факты, касающиеся кинетических и термодинамических параметров деактивации комплекса I. 1. АТР и/или энергизация сопрягающей мембраны снижает скорость спонтанной деактивации комплекса I. Влияние АТР предотвращается блокированием протон-транслоцирующей активности Fo∙F1 или удалением его F1-компонента. 2. Процесс деактивации прекращается при соотношении Д/А форм ~ 10 и это соотношение не зависит от температуры. Мы рассматриваем две возможности сохранения остаточной активности комплекса I после завершения деактивации. Согласно первой в сопрягающих мембранах существует равновесие между этими формами. Другая возможность состоит в существовании фракции фермента, вообще не подверженной процессу спонтанной деактивации. Существование такой фракции может быть обусловлено специфическим набором аннулярных фосфолипидов или посттрансляционной модификацией одной или нескольких субъединиц комплекса I. 1.2. Перенос электронов между редокс-компонентами Недавно мы показали ATP-зависимый сукцинат-поддерживаемый обратный перенос электронов на искусственный акцептор электронов гексаамминорутений (III) (HAR) Комплексом I в составе субмитохондриальных частиц (СМЧ) сердца быка. Оказалось, что этот путь нечувствителен к ингибированию NADH-связывающего центра фермента специфическим ингибитором - NADH-OH. Ранее мы показали, что NADH:HAR-редуктазная активность митохондриального, но не прокариотического (P.denitrificans), фермента аллостерически стимулируется ATP. Разумно было подтвердить или опровергнуть феномен нечувствительного к NADH-OH ATP-зависимого сукцинат-поддерживаемого восстановления HAR на NDH-1 в составе вывернутых плазматических везикул P.denitrificans (СБЧ), т.к. для этого препарата отсутствуют аллостерические эффекты ATP. В настоящей работе мы показали, что 1) NADH:HAR-редуктазные активности СМЧ и СБЧ характеризуются различающейся немихаэлисовской кинетикой, которую можно объяснить существованием двух различных центров и/или механизмов восстановления этого акцептора. 2) Комплекс I и NDH-1 отличаются по параметрам взаимодействия NADH-связывающего центра с NADH-OH. 3) Блокирование NADH-связывающего центра NDH-1 этим ингибитором не препятствует энергозависимому восстановлению HAR. Таким образом, предложенная нами модель обратного переноса электронов от QH2 на HAR экспериментально подтверждена для первого пункта сопряжения дыхательной цепи прокариот. 2. Fo∙F1-АТРаза/синтаза В течение многих лет внимание нашей группы было сосредоточено на проблеме обратимости функционирования Fo∙F1 комплекса с использованием прочносопряженных пространственно инвертированных субмитохондриальных фрагментов. Полученные результаты привели нас к представлению, впервые сформулированному еще в 1980 году, о том, что механизмы синтеза и гидролиза АТР различны.Анализ обоих процессов позволил сформулировать гипотезу о существовании двух независимо функционирующих изоформ Fo∙F1: АТРазы и АТРсинтазы. В настоящей работе мы сообщаем о результатах изучения кинетики синтеза АТР и изменений мембранного потенциала в мембранах P. denitrificans, демонстрирующих классическое явление дыхательного контроля. При значении рН среды 7,0, при котором гидролитическая активность Fo∙F1 почти отсутствует, и 8,0, при котором эта активность соизмерима с АТР синтазной, кинетика синтеза или гидролиза АТР и электрических ответов мембран соответствует модели функционирования двух независимых (неравновесных) изоформ Fo∙F1. Публикации 1. Виноградов А.Д. Новый взгляд на проблему обратимости синтеза и гидролиза АТР Fо∙F1-АТРазой (гидролазой) (2019) Биохимия, 84, 1553-15639. doi: 10.1134/S0320972519110034 2. Т.В. Жарова, А.Д. Виноградов. Fo∙F1-АТРаза/синтаза прочносопряженных суббактериальных фрагментов Paracoccus denitrifican: кинетика синтеза АТР (2019) Спецвыпуск "ActaNaturae", том 2, тезисы, с. 102 (Объединенный Научный Форум, VI Съезд Физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России IX, Российский симпозиум «Белки и пептиды»). 3. Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Кинетические и термодинамические параметры деактивации митохондриальной NADH:убихинон-оксидоредуктазы (дыхательного комплекса I) (2019)Спецвыпуск "ActaNaturae", том 2, тезисы, с. 102-102 (Объединенный Научный Форум, VI Съезд Физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России IX, Российский симпозиум «Белки и пептиды»). 4. Гладышев Г. В., Виноградов А.Д. Перенос электронов между редокс компонентами энергопреобразующих NADH:хинон оксидоредуказ (2019) Спецвыпуск "ActaNaturae", том 2, тезисы, с. 106 (Объединенный Научный Форум, VI Съезд Физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России IX, Российский симпозиум «Белки и пептиды»).
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Энергетика аэробной клетки
Результаты этапа: За истекший период были получены следующие результаты. I. Дыхательный комплекс I. 1. Мы подтвердили, что комплекс I представляет собой количественно «главный» компонент дыхательной цепи компонент дыхательной цепи, генерирующий АФК, и показали, что распределение между образованием двух форм АФК (перекись водорода и супероксид-радикал) зависит от концентрации субстрата-донора (NADH). При низких концентрациях NADH фермент образует супероксид, а при повышении концентрации NADH происходит перераспределение АФК с преимущественным образованием перекиси водорода. Кроме того, мы провели изучение генерации АФК дыхательным комплексом II (сукцина:убихинон редуктаза). На основании анализа кинетики генерации АФК комплексом II была предложена гипотеза об индукции дикарбоксилатами значительных структурных изменений в области, прилегающей к железо-серному кластеру S3 комплекса 2. Тридцать лет тому назад нашей группой было описано превращение протон-транслоцирующей каталитической активности NADH:убихинон-редуктазного участка дыхательной цепи митохондрий из «нормального» активного (А) состояния в неактивное (Д) и обратно (А/Д переход, Complex I A/D transition). Это явление привлекло внимание главных исследовательских групп, работающих в области биоэнергетики в Европе, США и Великобритании. В настоящее время ни его механизм, ни возможное физиологическое значение остается неизвестным и ограничивается гипотетическими предположениями. Нами были получены новые факты, касающиеся кинетических и термодинамических параметров деактивации комплекса I. 1. АТР и/или энергизация сопрягающей мембраны снижает скорость спонтанной деактивации комплекса I. Влияние АТР предотвращается блокированием протон-транслоцирующей активности Fo∙F1 или удалением его F1-компонента. 2. Процесс деактивации прекращается при соотношении Д/А форм ~ 10 и это соотношение не зависит от температуры. Мы рассматриваем две возможности сохранения остаточной активности комплекса I после завершения деактивации. Согласно первой в сопрягающих мембранах существует равновесие между этими формами. Другая возможность состоит в существовании фракции фермента, вообще не подверженной процессу спонтанной деактивации. Существование такой фракции может быть обусловлено специфическим набором аннулярных фосфолипидов или посттрансляционной модификацией одной или нескольких субъединиц комплекса I. Кроме того, мы изучили влияние энергизации мембран на параметры А/Д-перехода (скорости деактивации и активации хинон-редуктазной активности митохондриального комплекса I), используя в качестве объекта исследования прочносопряженные субмитохондриальные частицы. Мы предположили, что А/Д-переход отражает протон-транслоцирующую активность комплексов I. В рамках этой гипотезы, мы исследовали несколько факторов, влияющих на A/D переход (обратимая деактивация комплекса I) в сопряженных или разобщенных субмитохондриальных частицах сердца быка. Было обнаружено, что кинетика сильно зависимой от температуры деактивации отклоняется от первого порядка, и это отклонение устраняется в присутствии реагента, специфичного для SH-группы. Как полностью активный фермент, так и фермент, обладающий остаточной активностью после глубокой деактивации, демонстрируют одинаковую кинетику окисления НАДН. Показано, что скорость деактивации комплекса I лишь незначительно зависит от pH в диапазоне 7,0-8,5 и значительно увеличивается при более высоком pH. АТР(Mg) снижает скорость деактивации комплекса I в сопряженных SMP, и этот эффект исчезает после устранения протонодвижущей силы, генерируемой АТРазной активностью FoF1. В совокупности эти данные показывают, что существует равновесие между формами A и D комплекса I. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения о торможении деактивации в результате энергизация мембраны. На основании полученных данных мы описали возможный механизм процесса A/D перехода. Согласно последним данным А/Д-переход можно рассматривать как универсальное свойство всех протон-транслоцирующих NADH:хинон-редуктаз. Мы предполагаем, что А/Д-переход отражает протон-транслоцирующую активность комплексов I 3. На основе анализа взаимодействия митохондриального комплекса I с искусственным акцептором электронов гексааминорутением (III), было показано каталитически компетентное взаимодействие между гексааминорутением (III) и редокс-компонентом комплекса I, отличающемся от находящегося в субстрат-связывающем центе фермента флавинмононуклеотида. Мы показали ATP-зависимый сукцинат-поддерживаемый обратный перенос электронов на искусственный акцептор электронов гексаамминорутений (III) (HAR) Комплексом I в составе субмитохондриальных частиц (СМЧ) сердца быка. Мы обнаружили, что этот путь нечувствителен к ингибированию NADH-связывающего центра фермента специфическим ингибитором - NADH-OH. Мы показали, что NADH:HAR-редуктазная активность митохондриального, но не прокариотического (P.denitrificans), фермента аллостерически стимулируется ATP. У NDH-1 в составе вывернутых плазматических везикул P.denitrificans (СБЧ) отсутствуют аллостерические эффекты ATP. Мы сравнили чувствительность к NADH-OH ATP-зависимого сукцинат-поддерживаемого восстановления HAR на NDH-1 в составе вывернутых плазматических везикул P.denitrificans (СБЧ) и в составе субмитохондриальных частиц (СМЧ) сердца быка. Для выполнения этой задачи, предварительно были получены основные кинетические характеристики АТР-зависимого обратного переноса электронов, катализируемого сопряженными мембранами P. denitrificans. В результате мы показали, что 1) NADH:HAR-редуктазные активности СМЧ и СБЧ характеризуются различающейся немихаэлисовской кинетикой, которую можно объяснить существованием двух различных центров и/или механизмов восстановления этого акцептора. 2) Комплекс I и NDH-1 отличаются по параметрам взаимодействия NADH-связывающего центра с NADH-OH. 3) Блокирование NADH-связывающего центра NDH-1 этим ингибитором не препятствует энергозависимому восстановлению HAR. Таким образом, предложенная нами модель обратного переноса электронов от QH2 на HAR была экспериментально подтверждена для первого пункта сопряжения дыхательной цепи прокариот. На основании полученных результатов, мы пришли к заключению, что механизм энергетического сопряжения в NADH:убихинон-редуктазе (комплексе I) должен принципиально отличаться от предложенных ранее схем и может представлять собой редокс-зависимый протонный насос, требующий конформационных изменений фермента. Экспериментальное решение этой задачи требует разработки новых подходов для получения препаратов сопряженных митохондриальных фрагментов, не содержащих FMN (флавинмононуклеотид). Мы начали работу по получению таких препаратов с использованием химической модификации и/или удаления флавина связыванием его апобелками. Работа в этом направлении продолжается. III. Протон-транслоцирующая F1∙Fо АТРаза/синтетаза. В течение многих лет внимание нашей группы было сосредоточено на проблеме обратимости функционирования Fo∙F1 комплекса с использованием прочносопряженных пространственно инвертированных субмитохондриальных фрагментов. Полученные результаты привели нас к представлению, впервые сформулированному еще в 1980 году, о том, что механизмы синтеза и гидролиза АТР различны. Применение нового экспериментального объекта, F1∙Fо АТРаза/синтетазы P. denitrificans, позволило нам детально проанализировать протекание реакции в направлении синтеза АТР. Впервые были прослежены синхронные изменения трансмембранного протонного потенциала и скорости потребления кислорода в ходе синтеза АТР инвертированными фрагментами плазматической мембраны P. denitrificans. Показано, что в контролируемом состоянии дыхания (состояние 4) фосфорильный потенциал (соотношение) АТР/ADPхPi не уравновешен протон-движущей силой. Предложен возможный механизм кинетического контроля синтеза АТР. Экспериментально проанализированы рН-зависимость F1∙Fо АТРаза/синтетазы и ее чувствительность к специфическому ингибитору вентурицидину. Показано одностороннее влияние цитоплазматического рН на катализ ферментом синтеза и гидролиза АТР. Показано значительное падение гидролазной активности фермента при снижении рН до 7,0, и при неизменной скорости окислительного фосфорилирования. На препаратах прочно сопряженных инвертированных плазматических мембран Paracoccus denitrificans получены характеристики действия вентурицидина, ингибитора эукариотического комплекса Fo∙F1. Мы детально проанализировали кинетику связывания и снятия ингибитора и показали, что параметры как ассоциации, так диссоциации ингибитора заметно различаются для синтеза и гидролизв АТР. Таким образом, нами было установлено, что эффективность ингибирующего действия вентурицидина значительно отличается в зависимости от направления реакции (гидролиз или синтез АТР), катализируемой Fo∙F1. Существенные различия в рН-зависимости и чувствительности к специфическому ингибитору вентурицидину позволили предположить существование в энерго-сопрягающих мембранах двух различных молекулярных изоформ Fo∙F1: одной, катализирующей синтез, и другой – гидролиз АТР. Кроме того, мы провели сравнительные исследования кинетики синтеза АТР и изменений мембранного потенциала в мембранах P. denitrificans, демонстрирующих классическое явление дыхательного контроля. Мы показали, что при значении рН среды 7,0, при котором гидролитическая активность Fo∙F1 почти отсутствует, и 8,0, при котором эта активность соизмерима с АТР синтазной, кинетика синтеза или гидролиза АТР и электрических ответов мембран также соответствует модели функционирования двух независимых (неравновесных) изоформ Fo∙F1. Публикации 1. Vinogradov A.D., Grivennikova V.G. Oxidation of NADH and ROS production by respiratory complex I. (2016) Biochim. Biophys. Acta, 1857, 863-871 2. TatyanaV. Zharova, AndreiD. Vinogradov.pH-dependence of Fo∙F1-ATPase/synthase activities in Paracoccus denitrificans tightly coupled inside-out plasma membranes. Abstract of 19 EBEC (2016) Riva del Garda, Italy, BBA – Bioenergetics, 1857, Supplement, e60 3. Vera G. Grivennikova, Andrei D. Vinogradov. Respiratory complex II catalyzed ROS production. Abstract of 19 EBEC (2016) Riva del Garda, Italy, BBA – Bioenergetics, 1857, Supplement, e77-e78 4. Grivennikova V.G. Kozlovsky V.S., Vinogradov A.D. Respiratory complex II: ROS production and the kinetics of ubiquinone reduction (2017) Biochim. Biophys. Acta, 1858, 109-117. 5. Zharova T.V., Vinogradov A.D. Functional heterogeneity of Fo•F1H+-ATPase/synthase in coupled Paracoccus denitrificans plasma membranes (2017) Biochim. Biophys. Acta, 1858, 939-944. 6. Grivennikova V.G. Kareyeva A.V., Vinogradov A.D. Oxygen-dependence of mitochondrial ROS production as detected by Amplex Red assay (2018) Redox Biol., 17, 192-199 7. Gladyshev G.V., Grivennikova V.G., Vinogradov A.D. FMN site-independent energy-linked reverse electron transfer in mitochondrial respiratory complex I (2018) FEBS Lett. 592, 2213-2219. 8. Vinogradov Andrei D., Gladyshev Grigory V., Grivennikova Vera G. NAD+ Binding Site -Independent Energy-Linked Reverse Electron Transfer in Respiratory Complex I. Abstract of 20 EBEC (2018) Budapest, Hungary, BBA – Bioenergetics, 1859, Supplement, e43 9. Виноградов А.Д. Новый взгляд на проблему обратимости синтеза и гидролиза АТР Fо∙F1-АТРазой (гидролазой) (2019) Биохимия, 84, 1553-15639. 10. Т.В. Жарова, А.Д. Виноградов. Fo∙F1-АТРаза/синтаза прочносопряженных суббактериальных фрагментов Paracoccus denitrifican: кинетика синтеза АТР (2019) Спецвыпуск "ActaNaturae", том 2, тезисы, с. 102 (Объединенный Научный Форум, VI Съезд Физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России IX, Российский симпозиум «Белки и пептиды»). 11. Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Кинетические и термодинамические параметры деактивации митохондриальной NADH:убихинон-оксидоредуктазы (дыхательного комплекса I) (2019) Спецвыпуск "ActaNaturae", том 2, тезисы, с. 102-102 (Объединенный Научный Форум, VI Съезд Физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России IX, Российский симпозиум «Белки и пептиды»). 12. Гладышев Г. В., Виноградов А.Д. Перенос электронов между редокс компонентами энергопреобразующих NADH:хинон оксидоредуказ (2019) Спецвыпуск "ActaNaturae", том 2, тезисы, с. 106 (Объединенный Научный Форум, VI Съезд Физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России IX, Российский симпозиум «Белки и пептиды»). 13. Grivennikova VG, Gladyshev GV, Vinogradov AD. Deactivation of mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase (respiratory complex I): Extrinsically affecting factors. (2020) Biochim. Biophys. Acta, 1861, 148207.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".