ИСТИНА

Для изучения функционирования генов полезен анализ фенотипического проявления изменения уровня экспрессии данного гена в клетке. Метод интерференции РНК позволяет специфически подавить экспрессию конкретного гена путем введения в клетку так называемых малых интерферирующих РНК, способствующих деградации соответствующей мРНК. Мы воспользовались этим методом для изучения функции ядерного онкобелка протимозина альфа (ПроТа). С этой целью был сконструирован экспрессионный вектор, направляющий синтез в культуре клеток человека малой интерферирующей РНК, мишенью которой является мРНК ПроТа. Подавление экспрессии гена ПроТа в клетках HeLa, трансфецированных данной плазмидой, было доказано с помощью трех разных методов: блот-гибридизацией РНК, электрофоретическим анализом частично очищенного ПроТа и иммуноферментным анализом ПроТа в клеточных лизатах. Специфичность наблюдаемого эффекта была продемонстрирована отсутствием влияния на экспрессию генов актина, гистона Н1, IkBa и прокаспазы-3. Кроме того, исследовали влияние ПроТа-специфичных siRNA с одной или несколькими точечными мутациями на экспрессию гена ПроТа. Методом блот-гибридизации РНК было показано, что такие мутации инактивируют siRNA и деградации мРНК ПроТа не происходит. Это подтвердило специфичность нашей системы Показано, что снижение концентрации ПроТа в клетках HeLa методом интерференции РНК приводит к подавлению экспрессии гена гемоксигеназы-1 (одного из генов ответа клетки на окислительный стресс) как в нормальных условиях, так и в условиях окислительного стресса. Это подтвердило нашу модель участия протимозина альфа в защите клетки от окислительного стресса. Полученные результаты проливают свет на новую функцию протимозина альфа - участие этого белка в ответе клетки на окислительный стресс.