ИСТИНА

1. Продемонстрировано влияние большой и малой субъединиц эндонуклеазы рестрикции BspD6I на функционирование друг друга. Показано, что начальная скорость гидролиза ДНК-субстрата большой субъединицей в присутствии малой субъединицы в 2 раза выше. Установлено, что катализ гидролиза двух цепей ДНК эндонуклеазой рестрикции BspD6I происходит, когда обе ее субъединицы находятся в составе одного фермент-субстратного комплекса, вместе с тем малая субъединица может расщеплять ДНК уже после того, как большая субъединица «разрезала» свою цепь. 2. Установлено, что большая субъединица эндонуклеазы рестрикции BspD6I (никующая эндонуклеаза) индуцирует изгиб ДНК при связывании с субстратом. Угол изгиба ДНК составляет 66 ± 4°. 3. Впервые обнаружено влияние ненуклеозидной вставки, содержащей остаток азобензола и находящейся в различных положениях ДНК-лиганда, на функционирование эндонуклеазы рестрикции BspD6I. Каталитическая активность большой субъединицы при этом не является единственно необходимым фактором для проявления активности малой субъединицы. Большая субъединица сближена с участками гидролиза ДНК малой субъединицей, обеспечивая её локализацию на ДНК. 4. В качестве ингибиторов активности большой субъединицы эндонуклеазы рестрикции BspD6I при 25°С предложено использовать ДНК-лиганды с модифицированным межнуклеотидным узлом в месте гидролиза и одноцепочечными разрывами. Повышение температуры реакционной смеси до 45°С приводит к диссоциации дуплексов-ингибиторов, высвобождению фермента и восстановлению его активности. 5. Впервые показано, что самокомплементарные олигодезоксирибонуклеотиды, селективно присоединенные к димеру мутантной формы эндонуклеазы рестрикции SsoII в непосредственной близости от его ДНК-связывающего центра, блокируют гидролиз субстрата при 25°С. Продемонстрировано существенное увеличение эффективности гидролиза субстрата ДНК-белковым конъюгатом при повышении температуры. «Включение» и «выключение» активности конъюгата эндонуклеазы рестрикции SsoII с олигодезоксирибонуклеотидом в интервале от 25 до 45°С обратимо и может происходить в течение двух циклов нагревания-охлаждения.