ИСТИНА

Большинство макромолекул, функционирующих в митохондриях, попадают в эти органеллы из цитоплазмы. Процесс импорта белков изучен достаточно полно, чего нельзя сказать о процессе импорта в митохондрии РНК. Феномен импорта тРНК в митохондрии наблюдается у простейших, растений, дрожжей, а также у сумчатых млекопитающих. Набор импортируемых молекул и механизмы этого процесса различаются для всех этих групп живых организмов. В случае почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae было показано, что из цитоплазмы в митохондрии импортируется два вида тРНК – тРНКLysCUU и тРНКGln. Импорт тРНК является высокоспецифичным процессом, так как одна из двух изоакцепторных лизиновых тРНК (тРНКLysCUU, далее – тРЛ1) направляется в митохондрии дрожжей, в то время как вторая (тРНКLysUUU, далее – тРЛ2) присутствует только в цитоплазме. Такое различие в локализации довольно близких тРНК может быть объяснено отличиями в структуре этих тРНК. Помимо этого, было показано, что в импорте тРЛ1 принимают участие три растворимых цитоплазматических белка. Первый из них – это цитоплазматическая лизил-тРНК-синтетаза (Krs1p), аминоацилирующая тРЛ1. Второй белок – это предшественник митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (preMsk1р), который, как предполагается, является переносчиком тРЛ1 через митохондриальные мембраны. Наконец, третий белок – это гликолитический фермент енолаза. Ее функция в импорте тРНК в митохондрии дрожжей остается неясной. Подавляющее большинство импортируемых тРНК других видов живых организмов необходимы для митохондриальной трансляции. В то же время, вопрос о функции тРЛ1 в митохондриальном матриксе дрожжей к настоящему моменту остается открытым. Предположение об участии тРЛ1 в митохондриальной трансляции подтверждается только косвенными экспериментами. Более того, митохондриальная лизиновая тРНК дрожжей (с антикодоном cmnm5UUU, далее тРЛ3) способна узнавать оба лизиновых кодона (AAA и AAG) в процессе митохондриальной трансляции. Изучение механизма импорта тРНК в митохондрии представляет особый интерес не только как одна из актуальных проблем современной биологии, но имеет и прикладное значение. Ряд наследственных болезней человека связан с мутациями в митохондриальных тРНК, приводящими к нарушениям функционирования органелл. Показано, что нарушения митохондриальной трансляции в клетках человека могут быть компенсированы при помощи искусственного импорта тРНК. Понимание молекулярного механизма импорта тРНК необходимо для совершенствования стратегий лечения таких болезней при помощи импорта тРНК в митохондрии. Целью данной работы являлось изучение формирования комплекса между тРЛ1 и preMsk1р, и с использованием полученных данных, создание штамма дрожжей, в котором тРЛ1 присутствовала бы исключительно в цитоплазме, и изучение фенотипического эффекта отсутствия тРЛ1 в митохондриях. Для достижения поставленных целей были поставлены следующие задачи: - оценить константу диссоциации комплекса тРЛ1-preMsk1р в отсутствии и присутствии енолазы 2; - определить, какие нуклеотиды тРЛ1 становятся защищенными от действия нуклеаз в результате взаимодействия с preMsk1р; - оценить эффективность импорта тРЛ1, направляемого различными мутантными версиями preMsk1р in vitro и in vivo; - в случае невозможности направления импорта тРЛ1 той или иной мутантной версией preMsk1р, оценить эффективность митохондриального дыхания и митохондриальной трансляции в клетках штамма дрожжей с соответствующей мутантной версией preMsk1р; - оценить эффективность митохондриального дыхания и митохондриальной трансляции в клетках штамма дрожжей, в которых ген preMsk1p заменен на ортологичный ген грибов Ashbya gossypii. В настоящей работе впервые измерена константа диссоциации комплекса тРЛ1-preMsk1p. Продемонстрировано также, что енолаза облегчает формирование данного комплекса. В данной работе впервые показана строгая корреляция между способностью мутантных и немутантных дрожжевых тРНК связываться с preMsk1p и возможностью их импорта в митохондрии дрожжей. Впервые подробно исследован комплекс импортируемой дрожжевой тРНК с preMsk1p. Показано, что структура этого комплекса значительно отличается от структуры канонических комплексов аминоацил-тРНК-синтетаз класса 2б с соответствующими тРНК, образование которых ведет к аминоацилированию. Продемонстрировано, что preMsk1p защищает от действия нуклеаз практически все нуклеотиды импортируемой тРНК. Впервые локализованы участки preMsk1p, ответственные за направление импорта тРНК в митохондрии дрожжей. В ходе данной работы впервые обнаружено, что N-концевой домен preMsk1p способен направлять импорт тРНК в митохондрии как in vitro, так и in vivo. Впервые прямо показано участие импортируемой тРНК в митохондриальной трансляции и обнаружено, что это участие является необходимым для эффективной трансляции только при повышенной температуре роста. Также выявлена причина такого температуро-зависимого эффекта. Полученные данные позволяют приблизиться к пониманию механизмов импорта тРНК в митохондрии дрожжей и могут быть использованы для разработки и совершенствования стратегий лечения наследственных заболеваний человека, вызываемых мутациями в генах митохондриальных тРНК.