ИСТИНА

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются одним из основных вызовов для современной медицины. Ежегодно в мире от ССЗ умирает около 18 миллионов человек, и этот показатель имеет тенденцию к росту. В связи с этим разработка новых препаратов, влияющих на гемостаз, представляется крайне актуальной задачей. При анализе генома медицинской пиявки Hirudo medicinalis нами была обнаружена целая группа генов, кодирующих белки, гомологичные описанному ранее антикоагулянту антистазину [1]. Структура антистазина характеризуется наличием двух гомологичных доменов, каждый из которых содержит по 10 остатков цистеина, формирующих пять внутридоменных дисульфидных связей. Белки с похожими антистазин-подобными доменами были найдены у многих многоклеточных животных. Целью данной работы являлось получение рекомбинантных антистазин-подобных белков H. medicinalis в эукариотической системе экспрессии и проверка их влияния на гемостаз. Всего было выбрано 14 открытых рамок считывания гомологов антистазина. ДНК-фрагменты, кодирующие антистазин-подобные белки, были получены методом ПЦР, используя в качестве матрицы кДНК-библиотеку слюнных желёз медицинской пиявки. Далее данные фрагменты были клонированы в составе плазмидных векторов, содержащих последовательности, кодирующие лёгкую цепь иммуноглобулина кролика с сигнальным пептидом под контролем промотора немедленно-ранних генов цитомегаловируса. Полученными векторами трансфицировали культуру клеток эмбриональной почки человека Expi293F, после чего оценивали накопление целевых рекомбинантных белков в культуральной жидкости. Химерные белки выделяли металл-хелатной хроматографией, после чего отщепляли лёгкую цепь иммуноглобулина кролика TEV-протеиназой и проводили очистку антистазин-подобных белков ионообменной хроматографией. При исследовании антикоагуляционных свойств полученных рекомбинантных белков для двух гомологов антистазина было продемонстрировано увеличение АЧТВ в сравнении с контролем.