ИСТИНА

Ключевым белком системы репарации мисматчей (MMR) является MutS. В случае бактерий E.coli MutS – гомодимерный белок, имеющий ДНК-связывающий, два АТФ-азных домена, а также домены, отвечающие за связывание с MutL и тетрамеризацию. Было показано, что, сканируя ДНК, MutS обнаруживает неканонические для ДНК пары (мисматчи), образовавшиеся в результате ошибок репликации. После обнаружения мисматча, MutS образует «излом» структуры ДНК до 60°. Впоследствии происходит обмен молекул АДФ, связанных белком, на АТФ, что приводит к значительным перестройкам в структуре MutS и образованию активированной конформации белка, так называемого «зажима». Именно этой конформации MutS приписывают способность активировать MutL и запускать последующие события в репарации повреждений ДНК. На сегодняшний день нет описания структурного перехода MutS в конформацию «зажима». Для исследования этого события нами было предложено использовать химическую фиксацию одноцистеиновых вариантов MutS на ДНК с 3’-дитиогрупой, также содержащих систему из двух флуорофоров для измерения Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET). Ранее нами были получены варианты MutS, содержащие единственный цистеин в ДНК-связывающем домене: MutS(N468C), MutS(A469C), MutS(N497C). В этой работе была охарактеризована их активность по способности активировать процесс репарации in vitro. Наиболее высокая активность наблюдалась для MutS(A469C), MutS(N497C) которые были использованы для фиксации на ДНК. Нам удалось добиться количественного выхода конъюгата как на дуплексе с мисматчем, так и на каноническом дуплексе. Также были подобраны условия очистки конъюгатов с помощью ВЭЖХ на носителе Superdex-200. Была изучена эффективность обмена нуклеотидов MutS, фиксированного на ДНК, что указывало на сохранение функциональной активности белка. MutS(A469C) проявил высокую активность в зафиксированном на ДНК состоянии, тогда как MutS(N497C) оказался мало активным. Фракции, соответствующие конъюгату MutS(A469C) на ДНК с двумя флуорофорами использовали для функциональных исследований. Измерялась поляризация флуоресценции, что указывало на наличие комплекса, а также FRET, что указывало на наличие изгиба в ДНК. Для конъюгата MutS(A469C) и ДНК, содержащей G/T мисматч, в буфере, не содержащем нуклеотидов, наблюдались высокие значения поляризации флуоресценции и FRET, что указывало на наличие связи между белком и ДНК, а также на наличие изгиба ДНК, соответственно. После добавления АТФ, наблюдалось снижение FRET, при сохранении высокого сигнала поляризации флуоресценции. Этот факт указывает на изменение конформации ДНК с изогнутой на линейную, при сохранении ковалентной связи между MutS и ДНК. Этот эксперимент является подтверждением формирования конформации «зажима»MutS, имеющего низкое сродство к ДНК. Полученные данные планируется использовать для кристаллизации «зажима» MutS в комплексе с ДНК.